Сайт-специфическая рекомбинация в структурной эволюции мультикопийных плазмид, кодирующих гены систем рестрикции-модификации II типа

• Автор: Захарова, Марина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 152 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы рестрикциимодификации.

1.1.1. Рестрикция и модификация ДНК.

1.1.2. Сайтспецифическне эндонуклеазы и ДНКметилтрансферазы.

1.1.3. Ферменты системы рестрикциимодификации II типа

1.1.4. Ферменты системы рестрикциимодификации I типа

1.1.5. Ферменты системы рестрикциимодификации III типа

1.1.6. Молекулярная организация систем рестрикциимодификации

1.1.7. Распространение систем рестрикциимодификации.

1 Бактериальные плазмиды могут кодировать гены СРМ.

. Репликация плазмид.
. Роль сайтспецифической рекомбинации в стабильном наследовании мультикопийных плазмид.
. Механизмы стабильного наследования низкокопийных плазмид.
. Коныогация бактериальных плазмид
. Мобилизация бактериальных плазмид
. Сайтспецифическая рекомбинация между сайтами плазмиды
II. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И МАТЕРИАЛЫ
.1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
.1.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды рЕС
.1.2. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды
.1.3. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды 2.
.1.4. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды .
.1.5. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды
Прочие медоды.
1. Методики, используемые для получения рекомбинантных ДНК и для секвенирования ДНК.
2. Определение ферментативной активности сайтспецифичсских эндонуклеаз и ДНК метилтрансфераз
II.II.3. Определение места расщепления фосфоди эф ирной связи на субстратной ДК,
обнаруженных сайтспсцифических эндонуклеаз.
IIЛ 1.4. Методы исследования свойств бактериальных плазмид
ИЛИ. Основные буферы
II.IV. Питательные среды
II.V. Штаммы бактерий, бактериофаги, фаговые и плазмидные вектора.
II.VI. Материалы и реактивы.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ОБСУЖДЕНИЕ
III.I. Структурнофункциональная организация плазмиды рЕС
IIIЛ. 1. Гены эндонуклеазы рестрикции и ДНКметилтрансферазы системы I.
1.1.2. Идентификация района репликации плазмиды рЕС
1.1.3. Стабильное наследование плазмиды рЕС
ШЛА Мобилизация плазмиды рЕС9.
III.II. Структурнофункциональная организация плазмид и
. Гены 2Iи 8систем
. Репликация плазмид 8 и
. Стабильное наследование плазмид I8 и
. Мобилизация плазмиды .
. Мобилизация плазмиды
III.III. Структурнофункциональная организация плазмиды
ШЛИ. 1. Репликативные свойства плазмиды .
II1.III.2. Сайт стабильного наследования плазмиды .
Ш.Ш.З. Мобилизация плазмиды .
III.IV. Структурнофункциональная организация плазмиды 8.
III.IV.1. Гены эндонуклеазы рестрикции и ДНКметилтрансферазы системы I 1V.2. Репликатор плазмиды 8. Плазмиды, кодирующие гены СРМ, образуют две
группы несовместимости
I.IV.3. Сайт стабильного наследования плазмиды 8. Две группы
последовательностей сайтов сег мультикопийных плазмид.
III.IV.4. Мобилизация плазмиды 8. Два способа мобилизации мультикопийных
плазмид.
III.V. Организация геномов плазмид рЕС9, 2, I. и 8 с генами СРМ II типа.
III.VI. Модель рекомбинации между мульгикопийными плазмидами с участием i и
сег генетических детерминант
III.VII. Рекомбинация между мультикопийными плазмидами с участием и сег
генетических детерминант
III.VIII. Роль сег и рекомбинаций в структурной эволюции мультиконийных
плазмид.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
НТФ нуклеозидтрифосфат
АМФ адснозин5монофосфат
Трис трисгидроксиметиламинометан
ЭДТАКагЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ТХУ трихлоруксусная кислота
ДТТ дитиотреитол
ДДС додецил сульфат натрия
мМ молекулярная масса
нм нанометр оптическая длина волны
пМ пикомоль молекулярная масса
н.п. пар нуклеотидов
т.п тысяча пар нуклеотидов
н.п. пар нуклеотидов
ПЭГ полиэтилен гликоль
ПЭГ полиэтилен гликоль с молекулярной массой
ИПТГ изопроилтиоi алактозид изопропил1 тиорОгалактопиранозид
ПААГ полиакриламидный гель
а.о. аминокислотные остатки
Да дальтон
кДа килодальтон
X 5бром4хлор3индолилргалактозид ОРС открытая рамка считывания ПЦР полимеразная ценная реакция
Аденознлметионин дезоксиаденозин5метионин
оо.мин скорость вращения ротора
ВВЕДЕНИЕ


Добавление олигонуклеотидов с сайтом I ингибирует образование петель. Возможно, этот двухсайтовый механизм расщепления выработался для защиты ДНК клеток хозяина от рестрикции. Потому, что при такой схеме, фермент не может расщепить ДНК хозяина, если будет иметься только один неметилированный сайт и, поэтому, возникновение редких, не модифицированных сайтов, не летально для клетки. В датьнейшем, в нуклеотидной последовательности ДНК гена эндонуклеазы , был обнаружен район, гомологичный нуклеотидной последовательности ДНК активного участка ДНКл и газы 1 человека i, . Причем, отличие между двумя гомологичными районами заключалось в том, что в эндонуклеазе в этом участке в положение расположен вместо , который, как известно, необходим ДНКлигазе I человека для проявления лигазной активности. Предложен возможный механизм эволюции СРМ I из общего предшественника топоизомераз иили лигаз с точечной мутацией в участке узнавания, которая повлекла за собой потерю лигазной активности. Недавно был проведен рентгеноструктурный анализ с разрешающей способностью 2. Л i . Было показано, что является гомодимером с двумя доменами на мономер. Один из доменов характерен для проявления эндонуклеазной активности, другой для топоизомеразной, что согласуется с данными полученными в предыдущих исследованиях. Домен, расположенный в копие белка, имеет укладку, характерную для других эндонуклеаз II т ипа, а также для X экзонуклеазы и белков репарации и V. Эти данные свидетельствуют об общем происхождении всех этих белков и механизма катализа. В соответствие с активностью домена, он получил название домен. Домен, расположенный в С конце белка, содержит, так называемый, САР мотив, обнаруженный в белке катаболитной репрессии САР и представленный во многих, связывающихся с ДНК белками, включая топоизомеразы I и II типов. Этот домен был назван соответственно Торо доменом. Таким образом, структура свидетельствует об общем происхождении многих белков, активность которых связаны с ДНК. В году, при сравнении аминокислотной последовательности эндонуклеазы II и аминокислотных последовательностей интегразиого семейства рекомбиназ. I и в мотиве, определяющем интегразное семейство , . Ранее было установлено, что гирозиновый остаток в этом мотиве ответственен за катализ расщепления фосфодиэфирной связи инте разами. Замена соответствующего тирозина Туг8 на фенилаланин привело к тому, что мутантная эндонуклеаза II утратила способность расщеплять ДНК, однако, сохранила способность связываться с сайтом узнавания на молекуле ДНК. Эта работа убедительно продемонстрировала эволюционное родство ССЭН и ферментов, обслуживающих процессы интеграции и транзиции. Особый интерес, в последнее время, проявляется к II субкласса. К настоящему времени открыто более специфичностей, узнаваемых ЭР этого субкласса. В отличие от эндонуклеаз I типа, которые расщепляют субстратную ДНК случайным образом на широко варьирующем расстоянии от сайта узнавания, ССЭН субкласса СРМ II типа, гидролизуют фосфодиэфирную связь на молекуле ДНК на строго определенном расстоянии от сайта узнавания. Таким образом, эндонуклеазы субкласса II имеют различные узнающие и расщепляющие районы на ДНК, что делает их похожими на эндонуклеазы рестрикции СРМ III типа. Главное различие между этими типами СРМ заключается в том, что в случае II субкласса СРМ II типа, эндонуклеазы и метилазы являются отдельными белковыми молекулами, в то время как в СРМ III типа они представлены двухсубъединичными белками , . Отличие эндонуклеаз II субкласса от всех остальных, входящих в СРМ II типа, заключается в месте расщепления фосфодиэфирной связи на молекуле ДНК. В случае большинства ЭР, ДНК расщепляется в пределах симметричного участка узнавания идентичным образом по обеим цепям. ДНК расщепляется на фиксированном расстоянии вне асимметричного участка узнавания в данном случае 9 и н. Сайты узнавания большинства эндонуклеаз прототипов II субкласса имеют длину от 5 до 6 н. Исключением являются эндонуклеазы рестрикции , и i . ДИК длиной 7 и 4 н.