Генерирование мини-антител для исследования компонентов клеточного ядра

• Автор: Вятчанин, Антон Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Введение

Обзор литературы

1. Иммуноглобулины

1.1. Структура и генетика молекул иммуноглобулинов

1.2. Взаимодействия антитела с антигеном

1.3. Использование антител в исследованиях и медицине

1.4. Иммунизация

1.5. Поликлональные антитела

1.6. Моноклональные антитела

1.7. Рекомбинантные технологии получения антител 1В

2. Фаговый дисплей

2.1. Биология бактериофага М
2.2. Библиотеки последовательностей на основе бактеирофага М
2.3. Библиотеки v
3. Неканонические антитела представителей сем. Верблюдовые
3.1. Особенности неканонических антител
3.2. Технология фагового дисплея вариабельных доменов неканонических антител
3.3. Синтетические библиотеки неканонических антител
3.4. Свойства миниантител
3.5. Возможные способы использования миниантител
3.6. Преимущества миниантител для детекции антигена i viv
Материалы и методы
1. Оборудование
2. Реактивы
3. Антитела
4. Ферменты
5. Стандартные методы
5.1. Гельэлектрофорез в ПААГ
5.2. Вестернблот анализ
5.3. Осаждение белков метанолхлороформ
5.4. Иммуноферментный анализ
5.5. Очистка белка на iагарозс
5.6. Определение концентрации белка
5.7. Полимеразная цепная реакция.
5.8. Дефосфорилированис 5 и 3концов фрагментов ДНК
5.9. Рестрикция
5 Синтез кДНК
5 Горизонтальный гельэлектрофорез.
5 Определение концентрации нуклеиновых кислот
5 Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов
ферментативных реакций.
5 Переосаждение ДНК.
5 Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК
5 Препаративное выделение плазмидной ДНК
5 Бактериальные среды
5 Приготовление компетентных клеток линии .i.
5 Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.
5 Приготовление периплазматического экстракта
6. Работа с фагдисплейными библиотеками
6.1. Создание фагдисплейных библиотек
6.2. Амплификация фаговых частиц
6.3. Определение концентрации фаговых частиц
6.4. Селекция библиотеки
7. Методы, использованные в работе с i
7.1. Выделение экстракта ядер эмбрионов .
7.2. Выделение слюнных желез из личинок .
7.3. Клетки . i 2
7.4. Фиксация клеток . формальдегидом
7.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов слюнных желез
8. Методы, использованные в работе с двугорбым верблюдом
8.1. Иммунизация верблюда
8.2. Выделение и фракционирование I антител
8.3. Выделение Влнмфоцитов
8.4. Выделение РНК из Влимфоцигов
Объекты и задачи исследований
Результаты исследований
1. Использование нового модельного животного для создания библиотеки последовательностей вариабельных доменов неканонических антител
2. Исследование свойств новой библиотеки последовательностей миниантител, полученной иммунизацией бактриана экстрактом ядер .
3. Исследование нового подхода к генерированию миниантител с использованием библиотек, полученных в результате иммунизации верблюда сшитым i viv и затем дробленым ультразвуком хроматином
4. Сэндвмчиммунная селекция миниантител
5. Модификация фагапомощника, оптимизация метода фагового дисплея
6. Использование миниантител к ламину для i vi и i viv детекции антигена Обсуждение результатов
Выводы
Благодарности
Список литературы


Получение поликлональных антител из сыворотки иммунизированных животных наиболее простой и доступный метод. Более сложным и, вместе с тем, позволяющим получить более надежные антитела методом однажды полученные и охарактеризованные гибридомы представляют собой неограниченный источник моноклональных антител является гибридомная технология. Действительно, за последние десятилетня с помощью гибридомной технологии было получено большое число противораковых антител, однако применение их для лечебных целей наталкивается на серьезные ограничения, связанные с тем, что чужеродные мышиные антитела вызывают у человека гуморальный иммунный ответ, элиминирующий экзогенные протеины а в некоторых случаях приводящей к неблагоприятной анафилактической реакции. Для преодоления этих ограничений необходимо создавать новые рекомбинантные неприродные иммуноглобулины с заменой участков молекулы, не отвечающих за распознавание опухолевой клетки, на соответствующие фрагменты человеческого происхождения гуманизированные антитела, либо удалять домены, не вовлеченные в связывание антигена миннаптитела. В последнее время все больше применяются рекомбинантные технологии, основанные на работе с библиотеками последовательностей антител человека. Для построения таких библиотек в экспрсссионном векторе соединяют случайным перебором в одной рамке считывания вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, разъединенные линкерной последовательностью. Работа с очень громоздкими библиотеками таких одноцепочечных антител ясРу весьма трудоемка и имеет ряд узких мест. Результатом такой работы редко бывает высокоаффинное антитело. Определенные сложности связаны со стабильностью полученных генетических конструкций, низким уровнем экспрессии продукта и его растворимостью. Существенный технологический прорыв в этой области связан с обнаружением у представителей сем. Верблюдовые i неканонических антител, лишенных легких цепей и представляющих собой димер укороченных тяжелых цепей. Иммунный ответ с участием этих антител можно вызвать с помощью классической иммунизации. Использование репертуара этих неканонических антител для создания библиотек последовательностей вариабельных доменов только тяжелой цепи имеет целый ряд преимуществ. Однодоменная структура узнающего вариабельного домена обуславливает малый размер антигенсвязывающего фрагмента миниантитела и его высокую стабильность и растворимость. Благодаря особенностям своего строения, миниантитела могут использоваться для выявления скрытых для классических иммуноглобулинов эпитопов. Экспрессия с одного гена упрощает генноинженерные манипуляции и позволяет эффективно и экономично нарабатывать миниантитело в больших количествах в . Как следствие, существенно упрощаются работы с библиотеками последовательностей вариабельных доменов. Низкая иммуногснность являющаяся следствием высокой гомологии последовательностей миниантител с вариабельным доменом тяжелых цепей I3 человека и простота гуманизации открывает широкие возможности для использования миниангител для создания лекарственных препаратов нового типа. Возможности этой новой технологии мы исследовали и применили в данной работе с целью генерирования новых антител к эндогенным нативным эпитонам внутриклеточных белков. Структура и генетика молекул антител Расап Е. А., дает иммунной системе возможность воздействовать на чужеродные антигены посредством различных эффекторных механизмов. В последнее время благодаря развитию клеточной молекулярной иммунологии мы имеем достаточно подробное представление о механизмах функционирования антител. Эти знания позволяют создавать улучшенные молекулы для клинического применения. Структура иммуноглобулина Расап Е. А., , схематически показана на рис. Рис. Молекула имеет в свосм составе четыре белковые цепи две идентичные тяжелые и две легкие цепи. Тяжелые цепи отличаются между классами и подклассами антител, каждый из которых играет особую роль в иммунном ответе. Легкие цепи представлены двумя типами к и X не различающимися но своим функциям.