Исследование регуляции Н +-АТФазы плазматических мембран высших растений белками 14-3-3 при абиотическом стрессе

• Автор: Шанько, Андрей Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Стратегия восприятия стресса у растений.

1.2. Передача сигнала при абиотическом стрессе.

. Воздействие солевого и осмотического стрессов на растения

1.4. Воздействие низких температур на растения.

1.5. белки клеточные регуляторы растительного метаболизма

1.6 белки как активаторы НЛТФазы плазматических мембран

1.7. Цели и задачи исследования

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Выращивание растений и создание абиотических стрессов

2.3. Определение морозостойкости озимой пшеницы.
2.4. Определение сояеустойчивости сортов ячменя.
2.5. Определение содержания ионов Ла в тканях растений.
2.5. Измерение транспортной активности НЛТФазы в корнях проростков ячменя.
2.6 Выделение плазматических мембран из растений
2.7. Измерение количества ФКСС в плазматических мембранах растений .
2 8 Измерение ЛТФгидролазной активности НЛТФазы в плазматических мембранах
растений.
2.9. Вестерн бл от тин г быков .
2. Выделение РНК из растений
2 Синтез кДНК реакция обратной транскрипции.
2 Дизайн праймеров
2 Измерение экспрессии генов белков
2 Определение меристемы и зоны перехода клеток к растяжению в корнях проростков кукурузы
2 Определение зон закисяения и защелачивания внешней среды апексом корня кукурузы.
2 . Измерение транспортной активности ИАТФазы в корнях проростков кукурузы
2 Выделение мембран, ДСНПААГЭ и иммунодетекция белков из корней проростков кукурузы
2 Статистическая обработка данных.
2 Реактивы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. действие СОЛЬ ВОЮ И ОСМОТИЧЕСКОГО стрессов ил РАСТЕНИЯ ЯЧМЕНЯ НояОЕим госткгим Ь
3.1.1. Определение солеустойчивоапи сортов ячменя.
3.1.2. Накопление ионов Ло а корнях проростков яч меня при солевом стрессе
3.1.3. Измерение выхода протонов из отделенных отрезков корней проростков ячменя.
З Измерение АТФгидролазной активности НАТФачы, количества ФКСС, количества белка НАТФачы и белков в препаратах магматических мембран из корней
проростков ячменя.
3.1.5 Измерение экспрессии изоформ генов белков в корнях проростков ячменя
3.2. Действие солевого и осмотического стрессов на апекс корня проростков кукурузы
3.2.1. Определение меристемы и зоны перехода к растяжению клеток апекса корня проростков кукурузы
3.2.2. Измерение тока протонов в отрезках апекса корня проростков кукурузы
3.2.3. Иммунодетекция белков по длине апекса корня проростков кукурузы.
3.3. Действие солевого стресса на растения томата
3.3.1. Определение солеустойчивых сортов томата и накопления ионов Да а растениях при солевом стрессе
3.3.2. Измерение количества ФКСС в целых растениях томата, количества ФКСС и ингибирования роста корня в проростках томата при солевом стрессе.
3.4. Действие холодового стресса ил растения томата, огурца и озимой пшеницы
3.4.1. Определение морозостойкости пшеницы7Я
3.4.2. Измерение количества ФКСС н проростках озимой пшеницы при холодовим стрессе
3.4.3. Измерение количества ФКСС в томатах, огурцах и пшенице при холодовом стрессе
4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Действие, холодового стресса на растения томата, огурца и озимой пшеницы.
4.2. Действие солевого и осмотического стресса на растения ячменя.
4.3. Действие солевого стресса на растения томата.
4.4. Действие солевого и осмотического стресса на апекс корня ку курузы.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
8. СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.
9. БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
iv , элемент генома, отвечающий на действие АБК, Са2зависимые протеинкиназы,
iv , элемент генома, отвечающий на действие осмотического стресса,
x экспрессируемые части генома,
рецептор ассоциированный с белком,
1Р3 инозитол 1,4, 5 трифосфат,
подобные гены i гены,
I iv , элемент генома, отвечающий на действие низких температур,
МАРК митоген активируемые протеинкиназы,
Р2 фосфатиди л инозитол 4, 5бифосфат,
фосфолипаза С,
фосфолипаза ,
iv x i, акгивные формы кислорода,
v iivi, изначально мутанты арабидопсиса с блокированными генами, критическими в солеустойчивосги растения, а так же сами гены,
АБК, АВА абсцизовая кислота,
ДСНПААГЭ полиакриламидный гельэлектрофорез с додецилсульфатом натрия денатурирующий,
ФК фузикокцин,
ФКСС ФКсвязывающие сайты, рецензоры ФК.
ВВЕДЕНИЕ


Далее сигнал распространяется по цепочке вторичные мессенджеры изменяют внутриклеточный уровень ионов Са2 тем самым запуская каскад протеинкиназ и фосфопротеинфосфотаз, в который непосредственно вовлечены внутриклеточные белки регуляторы и факторы транскрипции. При активизации последних усиливается экспрессия специфических стрессиндуцибельиых генов и продукты этих генов, такие как АБК, этилен, салициловая кислота, начинают новый цикл внутриклеточной регуляции. Эффекгивная работа схемы передачи сигнала зависит от точного пространственного и временного взаимодействия всех молекул вовлеченных в этш процесс. В системе существуют молекулы напрямую не участвующие в передаче сигнала, но отвечающие за сборку и взаимосвязь основных компонентов например белки адапторы рис. Сигнал
Рецепторы Каналы. ККНВРАР2. Рисунок 1. Общая схема передачи сигнала внутри растительной клетки Рег1, . Абиотические стрессы состоят из множества компонентов, активирующие в клетке разнообразные, зачастую пересекающиеся, метаболические реакции. Так, например, солевой стресс содержит две компоненты осмотическую и ионтоксическую, а Холодовой стресс также уменьшает осмотический потенциал воды в клетке и т. По этой причине множественности абиотического воздействия отсутствует единый сенсор для каждого типа стресса, что влияет на построение всей сети путей передачи сигнала. Стрессфактор может активировать множество сигнальных цепочек, различных во времени, пространстве и положении относительно главной основной цени прохождения сигнала. Эти сигнальные пути могут взаимодействовать между собой и с другими клеточными компонентами, образуя, таким образом, сложную регуляторную сеть рис. При восприятии сигнала засухи, холодового или солевого стресса, дальнейшим ответом является увеличение концентрации ионов Са2, в цитоплазме i, . Таким образом, Са2каналы, первично реагирующие на эти сигналы, могут считаться сенсорами этих сигналов. Открытие этих каналов может быть следствием прямого физического воздействия на структуры клетки. Подтверждением этого является исследование i с коллегами i . Са2 при холодовом стрессе обусловлено именно резким снижением температуры и ни чем иным. Также одними из ранних изменений в клетке в ответ на Холодовой стресс являются изменения в вязкоеги мембран и реорганизации цитоскелета . Другим типом мембранного сенсора для низких температур может являться двухкомпонентная гистидинкиназа. В цианобактериях гистидин киназа i i . В клетках растений при осмотическом и холодовом стрессах усиливается синтез и накопление осмолитов и антиоксидантов . МАРКкаскад. МАРКкаскад активируется такими сенсорамирецепторами как тирозинкиназа, рецепторами ассоциированными с белками и двухкомпонентной гистидинкиназой. В iii была обнаружена двухкомпонентная гистидинкиназа i. Еще одним из первичных сенсоров сгрессовых факторов являются рецепторы ассоциированные с бслками. Гак активность фосфолипазы С в растениях регулируется бслками и продукт реакции этого фермента фосфоинозитол регулирует экспрессию подобных генов i в ответ на сигналы абиотического стресса , . Б ответ на понижение температуры, засуху или солевой стресс одним из ранних ответов является временное увеличение концентрации Са2 в цитозоле. Этот процесс обуславливается притоком экстраклеточного Са2 из апопласта или высвобождением из внутренних компартментов. Высвобождение Са2 внутри клетки контролируется лиганд зависимыми Са2каналами. Эти лиганды так же являются вторичными мессенджерами обнаруженными в животных и растительных клетках. Например, инозитолфосфат, цАМФ, НАДФ и д. Важная роль Са2 как сигнальной молекулы проявляется при повторении кальциевых всплесков осцилляциях. Осцилляции могут образовываться как вторичными мессенджерами 1го цикла, так и другими сигнальными молекулами например АБК, которые в свою очередь являются продуктом каскада инициированного более ранним всплеском концентрации Са2. Циклы Са2 сигналов могут иметь довольно сложную последовательность и различное физиологическое значение рис. Рисунок 1. Повторения Са всплесков осцилляции при восприятии и передачи первичного сигнала.