Поиск ферментов, контролирующих ядерно-цитоплазматическое распределение белка YB-1 в клетках млекопитающих

• Автор: Сорокин, Алексей Витальевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Ядсрноцитоплазматичсский транспорт белков .

1. Введение

2. зависимый ядсрноцитоплазматический транспорт белков

2.1. Сигналы ядерноцитоплазматического транспорта и транспортные факторы

2.1.1. Сигналы ядерной локализации и кариофериныа

2.1.2. Сигналы ядерной локализации и импортины

2.1.3. Сигналы ядерного экспорта и экспортины.

2.2. Строение ядерного порового комплекса, нуклеопорины.

2.3. Модель зависимого транспорта.

2.3.1. , регуляторы
2.3.2. Посадка комплекса кариоферинаимпортинрсМЬБбелок на .
2.3.3. Прохождение комплекса кариоферинаимпортинрПсЫЬБбелок через центральный канал ядерной поры.
2.3.4. Разборка комплекса карноферинаимпортинрсНЬБбелок.
2.3.5. Перемещение белков из ядра в цитоплазму
2.3.6. связывающие белки
2.4. Транспорт белков внутренней ядерной мембраны.
3. независимый ядерноцитоплазматический транспорт белков.
4. Регуляция ядерноцитоплазматического транспорта
4.1. Регуляция транспорта за счт модуляции взаимодействий импортинаэкспортина с сигналом субстрата
4.1.1. Маскирование сигналов субстрата от узнавания импортиномэкспортином.
4.1.1.1. Внутримолекулярное маскирование сигналов субстрата.
4.1.1.2. Межмолекулярное маскирование сигналов субстрата
4.1.2. Регуляция транспорта за счт усиления связывания импотринаэкспортина с сигналом субстрата
4.1.3. Регуляция транспорта за счт удержания в цитоплазме или в ядре
4.1.4. Регуляция транспорта за счт котранспортировки и изменения субстратсвязывающих свойств кариоферина
4.2. Регуляция транспорта за счт изменения состава импортинов и экспортинов .
4.3. Регуляция транспорта за счт изменения состава нуклеопоринов.
II. Мультифункциональный ядерноцитоплазматический белок
1. История открытия белков семейства 1.
2. Структурнофункциональная организация 1.
2.1. Домен холодового шока
2.2. Скоицевой домен.
3. Функции 1 в ядре
3.1. Участие 1 в регуляции транскрипции
3.2. Участие 1 в репликации и репарации ДНК
3.3. Участие 1 в сплайсинге
3.4. Участие 1 в разборке ядрышек
4. Функции 1 в цитоплазме
4.1. Участие 1 в трансляции
4.2. Участие 1 в упаковке мРНК.
4.3. Участие 1 в регуляции стабильности мРНК.
4.4. Участие 1 в локализации мРНК
4.5. Участие белков семейства 1 в процессинге мРНК.
5. Ядерноцитоплазматический транспорт
5.1. Сигнальные последовательности в молекуле
5.2. Механизм ядерноцитоплазматичсского транспорта
5.3. Возможные механизмы регуляции ядерноцитоплазматического транспорта 1.
5.3.1. Регуляция транспорта 1 за счт взаимодействия с мРНК
5.3.2. Тромбин стимулирует переход 1 в ядро в эндотелиальных клетках
5.3.3. Переход 1 в ядро в комплексе с другими белками
5.3.4. Фосфорилирование 1 может влиять на его ядерноцитоплазматическое распределение.
6. УВ1ирак
Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Плазмидные конструкции
2. Выделение рекомбинантного 1 из ii i
3. Выделение мутантных форм 1 из ii i.
4. Выделение 1специфичной протеазы и протеасомы из лизата ретикулоцитов кролика
5. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии .
6. Расщепление 1 протеасомой
7. Фосфорилирование 1.
8. Определение киназ, фосфорилирующих 1, в полиакриламидном геле i i .
9. Обработка препаратов 1 рибонуклеазами.
. Центрифугирование 1протеазы в градиенте концентрации сахарозы
. Иммунологический анализ белковых препаратов иммуноблоттинг.
. Культуры клеток. Получение клеточггых, ядерных и цитоплазматических экстрактов и метаболическое мечение белков.
. Иммунопреципитация.
. Иммунофлуоресцентная микроскопия.
. Выделение плазмидной ДНК из ii i.
. Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР.
. Обработка плазмиды рестриктазами.
. Получение транскриптов РНК i vi
. Мечение РНК по 5концу и по кэпструктуре.
. Электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы.
. Анализ изменения подвижности комплексов белокРНК в геле.
. Бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика.
. Ультрафиолетовая перешивка 1 с мРНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. 1 перемещается в ядро в результате отщепления сигнала
цитоплазматического удержания под действием протеасомы
1.1. Обнаружение, выделение и идентификация протеазы, отщепляющей Сконцевой фрагмент 1.
1.2. протеасома расщепляет 1 убиквитин и независимым образом
1.3. Определение места расщепления 1 протеасомой.
1.4. 1 расщепляется протеасомой i viv в ответ на ДНКповреждающий стресс
1.5. При ДНКповреждающем стрессе укороченный 1 накапливается
в ядрах клеток
1.6. Появление укороченного 1 в ядрах может приводить к лекарственной устойчивости клеток.
2. Фосфорилирование киназой не оказывает существенного влияния на ядерноцитоплазматическое распределение 1.
2.1. Поиск киназ, вовлечнных в фосфорилирование 1 i vi
2.2. Поиск сигнального пути, вовлечнного в фосфорилирование 1 i viv.
2.3. 1 фосфорилируется киназой i vi.
2.4. Фосфорилирование киназой не оказывает существенного влияния на локализацию 1 в клетке
2.5. Фосфорилирование 1 киназой снижает ингибирующее влияние белка на кэпзависимую трансляцию
ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Расщепление протеасомой приводит к переходу 1 в ядро и может модулировать его функции.
2. Фосфорилирование киназой не оказывает существенного влияния на распределение 1 между ядром и цитоплазмой, но снижает ингибирующее влияние 1 на кэпзависимую трансляцию.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


А Схематичное изображение ядерного порового комплекса . Обозначения ЯМ ядерная мембрана, ЦФ цитоплазматическая фибрилла, ЯФ ядерная фибрилла. I Обзора литературы. Считается, что именно за счет взаимодействий с нуклеопоринами осуществляется активный транспорт белков через ядерный поровый комплекс. Селективный фильтр представляет собой сеть из несвсрнутых гидрофобных полипептидных цепей нуклеопоринов, выстилающих центральный канал . Б Ионы и маленькие нейтральные белки способны проходить через селективный фильтр порового комплекса за счт диффузии. В Большие молекулы или комплексы проникают через только в составе транспортных комплексов. Ядерный поровый комплекс это большой транспортр, пронизывающий ядерную мембрану. Ионы и маленькие нейтральные белки, не связывающиеся с нуклеопоринами, проникают через ядерный поровый комплекс за счт диффузии i , . Б. Если молекулы связываются с нуклеопоринами, диаметр туннеля увеличивается до нм Капп, и транспортировка идт намного быстрее рисунок 1В i i, i , . Селективный фильтр для малых бежов представляет собой сеть из несвернутых гидрофобных полипептидных цепей нуклеопоринов, выстилающих централыгый канал рисунок 1Б. Тем не менее, не смотря на сравнительно большой диаметр туннеля, некоторые, даже маленькие белки меньше кДа, такие как гистоны, проходят через только с посредниками , . Основным является транспорт при помощи посредника зависимый транспорт. Этот вид транспорта достаточно хорошо изучен. Основной отличительной его чертой является гидролиз , катализируемый . В транспорте, помимо , принимают участие и другие консервативные транспортные факторы. Импортэкспорт большинства белков, в том числе мембранных, рибосомных субчастиц и некоторых типов РНК происходит при помощи большого, эволюционно консервативного семейства транспортных факторов кариоферинов3 iР. Большинство кариофериновР осуществляют или ядерный импорт и называются импортинами, или ядерный экспорт и называются экспортинами лишь некоторые из них принимают участие как в экспорте, так и в импорте. Большинство кариофериновР напрямую взаимодействует со своими белкамисубстратами, но иногда и через адаптерный белок. Самым изученным адаптерным белком является эволюционно консервативный белок кариоферина iа, другое название импортин ii. Импортины связываются с сигналом ядерной локализации ii i в транспортируемом белке и перемещают субстрат в ядро. Экспортины связываются с сигналом ядерного экспорта x в транспортируемом белке и обеспечивают его транспортировку в цитоплазму. Помимо перечисленных, в транспорте в ядро и из ядра участвует дополнительно целый набор транспортных белков. Одним из ключевых белков среди них является аза . Роль в транспорте более подробно будет описана ниже смотри главу 2. I Обзора литературы. Рисунок 2. Упрощнная модель зависимого ядерноцитоплазматического транспорта белков. А Транспорт в ядро. Импорт белков с сигналом ядерной локализации осуществляется гстсродимером кариоферинаимпортинi обозначены а и р. Транспорт белков опосредованный участием только импортинов на схеме не показан. Б Транспорт из ядра. Большая часть экспорта белков с сигналом ядерного экспорта осуществляется экспортином обозначен ехр. В каждой эукариотической клетке происходит быстрый и направленный транспорт тысяч белков и РНК в ядро и из него. Большинство из них переносится с участием кариоферинов. Это целое семейство белков в клетках человека их не менее , а в дрожжах таблица 1 , . Транспорт белков в ядро впервые был показан для нуклеоплазмина i и большого Т антигена вируса V V Т i. V2 9 . Сигналы такого типа весьма распространены и консервативны. Их принято называть классическими или основными , i , i . Таблица 1. Члены семейства карнофернновр. Кар1 тестоны, рибосом, белки, 4, и др. IV , глюкокортикоидный рецептор, рибосом, белки x I1, 1, и др. Сопоставлены известные ортологи кариофериновр и их субстратов позвоночных и дрожжей. Многоточие в ячейках означает, что ортологи не найдены. Два названия одного транспортна приведены через . Таблица с изменениями из , .