Получение и анализ трансгенных растений Nicotiana tabacum со смысловой и антисмысловой формами агробактериальных генов ipt и iaaM

• Автор: Алексеева, Валерия Витальевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 130 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Фитогормоны.

1.1.1. Цитокинины.

1.1.1.1. Структурнофункциональные свойства цитокининов.

1.1.1.2. Биосинтез цитокининов.

1.1.1.2.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов v

1.1.1.2.2. Биосинтез цитокининов через тРНК

г 1.1.1.3. Метаболизм цитокининов в растениях

1.1.1.3.1. Конъюгация цитокининов

1.1.1.3.2. Деградация цитокининов

1.1.1.4. Рецепция, передача сигнала, транспорт и регуляторная роль цитокининов

1.1.2. Ауксины.
1.1.2.1. Открытие, структура и физиологические свойства ауксинов.
1.1.2.2. Биосинтез ИУК, метаболизм и транспорт ауксинов
1.1.2.3. Рецепция ауксинов и регуляция ауксинами экспрессии генов
1.3. Агробакгериальные гены биосинтеза цитокининов и ауксинов
1.4. Трансгенные растения с генами биосинтеза цитокининов и ауксинов агробактерий.
1.4.1. Трансгенные растения с геном i
1.4.2. Трансгснныс растения с генами биосинтеза ауксинов i и i.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.
2.1.1. Условия культивирования бактерий
2.2. Растения
2.3. Среды.
2.3.1.Среды для культивирования растений.
2.3.2. Микробиологические среды
2.4. Реактивы, растворы и ферменты.
2.5 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК
2.6. Введение метки в ДНК
2.7. Выделение суммарной растительной ДНК
2.8. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну
2.9. Гибридизация ДНК на фильтрах по Саузерну
2 Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фснола
2 РНКДНК гибридизация
2 ПЦРанализ рекомбинантных бактерий и трансгенных растений.
2 Определение степени метилирования ДНК.
2 Трансформация листовых дисков табака
2 Определение активности неомицинфосфотрансферазы II II
2 Экстракция цитокининов из растительного материала.
2 Экстракция и очистка ауксинов из растительного материала
2 Биотест на содержание ауксинов с помощью колсоптилей пшеницы
7 2 Стерилизация семян табака
2 Определение содержания хлорофиллов и каротиноидов в листьях.
2 Измерение Сгазообмена
2 Измерение флуоресценции хлорофилла в листьях растений.
2 Определение растворимого белка и углеводов в листьях табака.
2 Определение листовой поверхности листьев и общего сухого веса листьев .
2 Колонизация растений ассоциативными метилотрофными бактериями
v
2 Выделение хлоропластов.
2 Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода
2 Анализ устьиц
2 Прививка растений
2 Искусственное переопыление трансгенных растений табака.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 .Создание и изучение трансгенных растений ii , экспрессирующих агробакгериальный ген биосинтеза цитокининов.
3.1.1. Конструирование рекомбинантных плазмид с геном i под контролем одинарного промотора РНК вируса мозаики цветной капусты V
3.1.2. Агробакгериальная трансформация растений ii генетическими конструкциями с агробактериальными геном биосинтеза цитокининов
3.1.3. Молекулярногенетический анализ трансгенных растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с генами биосинтеза цитокининов
3.1.4. Морфологобиохимические характеристики растений с повышенным синтезом цитокининов
3.1.4.1. Анализ содержания цитокининов в iрастениях.
3.1.4.2. Вариабельность фенотипов iрастений.
3.1.5. Анализ метилирования ДНК в iрастениях табака.
3.1.6. Изучение влияния цитокининов на iрастения и их экспланты в нормальных условиях и при действии стрессовых факторов
3.2. Получение и анализ трансгенных растений с геном i
3.2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген i под контролем двойного промотора РНК вируса мозаики цветной капусты V
3.2.2. Агробактериальная трансформация растений ii генетическими конструкциями, содержащими агробактериальный ген биосинтеза ауксинов
3.2.3. Молекулярногенетический анализ растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с геном i.
3.2.4. Морфологобиохимические характеристики растений с повышенным синтезом ауксинов.
3.2.4.1. Анализ роста iрастений в условиях i vi
3.2.4.2. Анализ роста и развития iрастений в условиях закрытого грунта
3.2.4.3. Определение уровня эндогенных ауксинов
3.2.4.4. Репродуктивные свойства iрастений и анализ первого поколения трансгенных растений.
3.3. Изучение фотосшггетических параметров в трансгенных растениях с генами i и i.
3.4. Изучение химерных трансгенных растений табака с различным уровнем ауксинов и цитокининов
3.5. Исследование антисмыслового ингибирования генов биосинтеза фитогормонов в
трансгенных растениях табака
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ,
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
5УАМФ аденозинмонофосфат
БАП 6бензиламинопурин
БГТ бутилированный гидрокситолуол
БФС бромфеноловый синий
ДТТ дитиотрсйтол
2,4Д дихлорфеноксиуксусная кислота
ИАМ индолил3ацетамид
ИПА изопентсниладенин
ИППФ 2изопентенилпирофосфат
ИУК индолилуксусная кислота
МС среда МурасигаСкуга
НУК нафтилуксусная кислота
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
п.о. пара оснований
т.п.о. тысяча пар оснований
ФАР фотосинтетически активная радиация
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФСН фотосистема II
ЭДТА этилендиаминтстрауксусная кислота ЭПР эндоплазматический ретикулум СаМУ вирус мозаики цветной капусты шаМ ген триптофанмонооксигеназы таН ген индолилацетомидгидролазы рг ген изонснтенилтрансферазы прШ ген неомицннфосфотрансферазы II БОБ додецилсульфат натрия
ВВЕДЕНИЕ


Этим веществом оказался 6фурфуриламинопурин кинетин, образующийся как продукт деградации ДНК при ее автоклавировании в кислой среде рис. Скуг показал, что ауксины индуцируют растяжение клеток в культуре клеток табака, но для индукции клеточного деления требовалось одновременное добавление цитокинина. Первый природный цитокинин зсатин был выделен из незрелых семян кукурузы в году , , после чего были обнаружены и другие природные цитокинины в различных тканях и органах растений рис. Первоначально эти вещества назвали кининами, однако позднее это название заменили термином цитокинины. В настоящее время в растениях известна целая группа соединений, обладающих цитокининовой активностью. Наиболее богаты ими меристематически активные участки, особенно кончик корня, а также незрелые семена и плоды . Эндогенные цитокинины встречаются в форме свободных оснований, нуклеозидов и нуклеотидов, в виде связанных соединений с сахарами или аминокислотами, а также обнаружены в составе тРНК. Однако наиболее активными цитокининами являются зеатин и его рибозид. В химическом отношении все цитокинины являются производными аденина с различными замещающими группами у 6го атома углерода аденинового кольца табл. Кулаева, Муромцев и др. При аминогруппе у шестого атома молекулы пурина находится боковая цепь, которая может иметь различное строение. Например, в молекуле трансзеатина она представлена изопреноидной углеродной цепью, а молекула 6бензиламинопурина БАП включает в себя ароматическую группу. Боковая цепь цитокининов зеатинового ряда может находиться как в цис, так и в транс конфигурации. При этом активность трансзеатина значительно выше активности цисзеатина i, . Кроме того, в настоящее время известно значительное количество химических соединений иной структуры, обладающих высокой цитокининовой активностью рис. Иногда активность синтетических цитокининов в несколько раз превышает активность цитокининов пуринового ряда Кулаева, Муромцев и др. Чернядьев, . Некоторые из них широко используются в культуре клегок растений и в растениеводстве благодаря своей высокой цитокининовой активности и стабильности. Основное место синтеза цитокининов у вегетирующих растений апикальные меристемы корней. Клетки камбия, верхушки побегов и незрелые семена также могут синтезировать цитокинины . Из корней цитокинины пассивно транспортируются в надземные органы по ксилеме Лутова и др. Эти фитогормоны обладают широким регуляторным спектром действия, затрагивающим многие физиологические функции растения. Стимулируя одни процессы, цитокинины могут ингибировать другие, и тем самым осуществлять регуляцию в системе целого растения. Еще в классических экспериментах Скуга было продемонстрировано основное свойство фитогормонов, а именно участие более чем одного гормона в усилении биологического ответа. Позднее было установлено, что гормоны могут действовать как синергически, так и антагонистически. Например, цитокинины совместно с ауксинами стимулируют деление каллусных клеток, но оказывают противоположное действие в отношении стимуляции формирования пазушных почек. Соотношение концентраций этих двух важных гормонов растений в культуральной среде определяет характер морфогенетических процессов в растительной ткани. Рис. Структура некоторых природных и синтетических цитокининов. Кроме того, предполагают, что нормальное развитие листа контролируется соотношением гиббереллинов к цитокининам , . Цитокинины совместно с абсцизовой кислотой и ауксинами участвуют в регуляции открывания устьиц целого ряда растений Чернядьев, 6 i . Установлено, что цитокинины способны стимулировать процесс индукции клубнеобразования у картофеля, тогда как ауксины способствуют увеличению размеров клубней Романов, . Показано стимулирующее влияние цитокининов на выработку этилена в растениях многих видов Сагу . Между тем, действие цитокининов по предупреждению старения растений осуществляется благодаря ингибированию продукции этилена . Все это указывает на сложность и неоднозначность влияния этих гормонов друг на друга.