Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro

• Автор: Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 152 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обзор методов искусственной эволюции i vi

1.1.1. Классификация методов

1.1.2. Методы, основанные на мутагенезе.

1.1.3. Методы, основанные на рекомбинации.

1.1.4. Методы скрининга и селекции

1.1.5. Применение ДНК шаффлинга.

1.1.6. Искусственная эволюция i ii компьютерное моделирование

1.1.7. Дальнейшие перспективы развития методов искусственной эволюции
1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза ЦГТаза, ее продуценты и продукты реакции
1.2.1. Микроорганизмы продуценты ЦГТаз
1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз.
1.2.3. Свойства и применение циклодекстринов
1.2.4. Поиск и получение новых ЦГТазных штаммов.
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследований.
2.2. Микробиологические методы
2.2.1. Питательные среды
2.2.2. Селективные среды и буферы.
2.2.3. Условия культивирования и инокуляции.
2.2.4. Отбор почвенных образцов,
получение чистых линий, микроскопия
2.3. Биохимические методы
2.3.1. Определение оптической плотности биомассы.
2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности.
2.4. Молекулярнобиологические методы исследований
2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в
полиакриламидном геле
2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
2.4.5. Очистка ДНК хроматорафией с ДЭАЭцеллюлозой
2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами.
2.4.7. Выделение векторной ДНК медленным способом
2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК
2.4.9. Подготовка компетентных клеток
2.4 Трансформация компетентных клеток .i плазмидной ДНК.
2.4 Получение одноцепочечной ДНК.
2.4 Фрагментирование ДНК при помощи ДНКазы I и ультразвука
2.4 ДНК шаффлинг.
2.4 Выделение и очистка тотальной ДНК
2.4 Геномный шаффлинг
2.4 ДНКгеномный шаффлинг
2.4 Анализ тотальных ДНК при помощи метода
2.5. Реактивы и материалы
2.6. Составы использованных стандартных растворов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Проведение асимметричного ДНК шаффлинг а
с одно и двуцепочечными ДНК.
3.2. Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга
3.3 Проведение геномного шаффлинга между
алкалофильным штаммом i . и
ЦГТазным штаммом i .
3.4. Скрининг и отбор штаммов для ДНКгеномного шаффлинга 1
3.5. Проведение ДНКгеномного шаффлинга между алкалофильным штаммом i . 9 и
ЦГТазным штаммом ii .
3.6. Скрининг и отбор штаммов для ДНКгеномного шаффлинга 2
3.7. Проведение ДНКгеномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом ii . 9 и алкалофильным денитрификатором i iii I6.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью лабораторной эволюции белков является изменение их функций для достижения специфической цели при помощи мимикрирования природных процессов, ускорения и усовершенствования скрининга и селекции , . И хотя эволюция в течение 3 миллиардов лет породила множество белковых катализаторов, они не являются оптимальными для узкоспециализированного промышленного применения i . Когда природные ферменты стали использоваться в промышленности в качестве катализаторов для химического синтеза, обнаружилось, что часто не все они являются подходящими для этих целей. Изза плохой растворимости субстратов, распада нестабильных продуктов или побочных химических реакций условия для ферментативного синтеза являются неподходящими для широкомасштабного применения. К тому же изза участия в сложных биохимических взаимодействиях внутри клетки ферменты часто ингибируются своими собственными субстратами или продуктами, что может жестко лимитировать продуктивность биокаталитического процесса i, а. Для оценки возможности успешного проведения экспериментов по направленной эволюции важно выявить способности этой системы к рекомбинации. Такое разнообразие последовательностей , кодирующих возможные варианты белков, просто поражает воображение. Похоже, что даже в течение столь длительной эволюции Природа смогла воспользоваться лишь малой частью такого разнообразия. В лаборатории оперирование таким огромным набором последовательностей жестко лимитировано изза того, что многие из этих последовательностей могут быть лишены нужных функций, таким образом лучше управлять эволюцией одного или нескольких существующих ферментов, чем искать необходимые функции в случайной библиотеке мутантных белков , , . Эволюция часто рассматривается как упражнение по восхождению к вершине и является наиболее удачной, если осуществляется в несколько маленьких этапов одна или несколько аминокислотных замен. И хотя можно никогда не достичь глобального оптимума, улучшения, достигаемые при осуществлении простых единичных аминокислотных замен, часто дают ощутимые положительные результаты. При осуществлении такого поэтапного восхождения множественные мутации накапливаются последовательно или при помощи рекомбинации. Однако восхождение к вершине, то есть адаптация популяции, осуществляется до определенного предела, дальше которого диверсификация уже невозможна i, , . Эффективность искусственного эволюционного процесса определяется мощностью метода поиска, частотой полезных мутаций и выбором исходных генов. Окажется ли искусственная эволюция способной решать определенные проблемы, зависит в какойто степени от того, как естественная эволюция уже поработала в этом направлении. Если нужное свойство уже находилось под давлением естественного отбора, то вряд ли дальнейшее улучшение может быть достигнуто в лаборатории небольшими мутациями. Тем не менее, если биологическая функция находится под дополнительным давлением, например, сцеплена с другой функцией, которая также находится под давлением отбора, тогда их баланс вполне может быть изменен лабораторной эволюцией. Широкое распространение одноклеточных организмов в природе не простое следствие индуцируемых ими спонтанных мутаций. Оказалось, в этих простых организмах протекает процесс, известный как гомологичная рекомбинация объединение экзогеных ДНК в гомологичных сайтах внутри бактериального генома. Рекомбинированные геномы несут характеристики родительской и экзогенной ДНК. Такие методы i vi рекомбинации являются очень гибкими и позволяют получить гибридные гены с множеством кроссоверов. Гомологичную рекомбинацию удалось мимикрировать в процессе, названном ДНК шаффлинг сексуальной ПЦР. Термин был введен в г. i для того, чтобы описать процесс, при котором была получена ТЕМ1 с 0кратно увеличенной активностью , а. Несомненно, этот механизм генерирования разнообразия является наиболее эффективным по сравнению с ранее используемыми методами. Традиционно селекция полезных и коммерчески выгодных ферментов происходит путем скрининга ферментов или микроорганизмов, которые приспособлены к экстремальным условиям внешней среды.