Клонирование, анализ структуры и характеристика регуляторных областей двух паралогичных генов эстрогенсульфотрансферазы крысы

• Автор: Астапова, Инна Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика сульфотрансфераз

1.2. Супсрссмейство генов сульфотрансфераз млекопитающих

Классификация и характеристика генов сульфотрансфераз.

1.2.1. Фенолсульфотрансферазы , 1

1.2.2. Гидроксиариламинсульфотрансферазы i, 1.

1.2.3. Сульфотрансферазы гиреоидных гормонов , 1.

1.2.4. Эстрогенсульфотрансферазы , 1

1.2.5. Гидроксисгероидсульфотрансферазы , 2 и 2
1.3. Особенности регуляции экспрессии эстрогенсульфотрансфераз в
различных тканях
1.3.1. Регуляция экспрессии эстрогенсульфотрансфераз в эпителии молочной
1.2.2. Регуляция экспрессии эстрогенсульфотрансфераз в эндометрии.
1.2.3. Регуляция экспрессии эстрогенсульфотрансфераз в семенниках.
1.2.4. Регуляция экспрессии эстрогенсульфотрансфераз в печени.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Животные.
2.2. Материалы
2.3. Электрофорез.
2.4. Трансформация ii i плазмидной ДНК
2.5. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.6. Полимеразная цепная реакция
2.7. Скрининг библиотеки геномной ДНК крысы
2.8. Выделение и анализ ДНК рекомбинантных бактериофагов.
2.9. Амплификация фрагментов генов эстрогенсульфотрансфераз с
помощью ПЦР.
2 Определение нуклеотидных последовательностей ДНК.
2 Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
2 Выделение РНК
2 Картирование точек инициации транскрипции методом удлинения
затравки
2 Быстрая амплификация 5 концевых последовательностей кДНК эстрогенсульфотрансфераз крысы 5
2 Получение ядерного матрикса
2 Изучение связывания фрагментов гена с ядерным матриксом i vi
2. Выделение фракции ДНК, ассоциированной i viv с ядерным матриксом
в клетках печени крысы
2 Получение ядерных экстрактов.
2 Футпринтинг с ДНКазой I
2 Сдвиг подвижности в геле.
2 Репортерные конструкции
2 Условия трансфекций и культивирования клеток.
2 Измерение активности люциферазы и Ргалактозидазы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Геномная организация кодирующих районов генов и 2
3.2. Строение 5Н ГО мРНК 1 и 2 и геномная организация
5областей генов и 2.
3.3. Экзонинтронная структура генов и 2 крысы
3.4. Поиск и определение локализации элементов в 5области,
5нетранслируемых и нервом кодирующем экзоне гена
3.5. Изучение взаимодействия ядерных белков из печени крыс с потенциальными регуляторными участками гена .
3.5.1. Поиск сайтов связывания полспецифических регуляторных белков
в проксимальной промоторной области гена
3.5.2. Поиск сайтов связывания полспецифических регуляторных белков
в интроне 1 генов и 2
3.6. Изучение промоторной активности 5области гена в клетках
линии 2
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


БЛАГОДАРНОСТИ. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ А. ЫОН2АФ гндрокси 2ацетиламинофлуорен ПААГ полиакриламидный гель ПЭГ полиэтиленгликоль П. Т.п. Эстрогенсульфотрансферазы БТЕ ЕС 2. Это супсрссмейство включает ферменты, которые катализируют сульфирование ряда эндогенных и экзогенных соединений стероидов, нейромедиаторов, желчных кислот и биогенных аминов, а также некоторых лекарств и других ксенобиотиков. Таким образом, у млекопитающих они выполняют ряд важнейших функций, таких как уничтожение конечных продуктов катаболизма, дезактивация и биоакгивация ксенобиотиков в том числе некоторых канцерогенов, регуляция активности стероидных гормонов и нейротрансмиттеров. Универсальным донором сульфогруппы для этих ферментов является Зфосфоаденозинбфосфосульфат. ЙИЬ или БТЛЛТВ, гидроксиариламннсульфотрансферазы 8Ис или 8иЬТ1С, эстрогенсулъфотрансферазы е или 8иЬТ1Е и два подсемейства гидроксистероидсульфотрансфераз ЛД2А и 8иЬТ2В. Клонированы и охарактеризованы более десятка генов различных сульфотрансфераз человека и некоторых других видов млекопитающих. Их структуры характеризуются значительным сходством. Эти гены включают 7 кодирующих экзонов за исключением с1 и часто несколько альтернативных 5нетранслируемых экзонов. Консервативно также положение точек сплайсинга и длины экзонов. Интересно отметить, что у некоторых видов имеется несколько изоформ одного фермента, которые являются продуктами разных генов, образовавшихся, скорее всего, в результате дупликации единственного генапредшественника. Такие гены, называемые параюгами, как правило, располагаются в виде кластеров. У человека существует кластер из трех генов 11 и 12 образуют кластер на длинном плече хромосомы 2, а два гена 21 и 21 расположены на . К настоящему времени полностью охарактеризована структура только одного гена подсемейства гена человека, организация которою во многом сходна с организацией других генов сульфотрансфераз. Клонирована также 5область гена морской свинки, содержащая 2 первых экзона и предполагаемую промоторную обасть. Изучение свойств показало, что эти ферменты катализируют реакцию сульфирования природных эсторогснов со значениями Кщ в низком наномолярном диапозоне. Поскольку продукты каталитической реакции сульфированные эстрогены, не способны связываться со своими рецепторами и потому не обладают гормональной активностью, эстрогенсульфотрансферазы могут реально участвовать в поддержании баланса активных эстрогенов в тканях i viv и влиять на экспрессию контролируемых этими гормонами генов. Клонирование кДНК и прямое определение активности этою фермента позволило изучить особенности его тканевого распределения у различных видов животных. Таким образом, было установлено, что , повидимому, принимают участие в модуляции активности эстрогенов в таких органахмишенях этих гормонов, как молочная железа, матка, семенники и печень. Необходимо отметить, что наличие в печени представляет собой дополнительный механизм для осуществления ползависимой регуляции ее функций. К настоящему моменту клонированы две близкородственные кДИК эстрогенсульфотрансферазы из печени крысы, предположительно кодируемые двумя паралогичными генами. Экспрессия у крыс тканеспецифична и находится иод сложным гормональным контролем. РНК выявляется в матке и семенниках, однако наиболее высокая конценграция мРНК и самого фермента наблюдается в печени. Существуют данные, свидетельствующие о том, что экспрессия генаов i в печени крыс регулируется половыми стероидными гормонами и гормоном роста. Однако имеющиеся данные о характере этой регуляции не укладываются ни в одну из существующих схем зависимой от пола регуляции экспрессии генов в печени. Целыо настоящей работы было клонирование генаов крысы и определение их геномной организации, а также идентификация их промоторных районов и участков ДНК, принимающих участие в дифференцированной по полу регуляции транскрипции этогоих генаов.