Множественные формы ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз Crithidia Oncopelti

• Автор: Асеев, Виктор Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. РНКполимеразная активность ядер.

1.1.1. Общая характеристика.

1.1.2. Действие ингибиторов на РНКполимеразную активность ядер.

1.1.3. Внутриядерная локализация РНКполимеразных активностей.

1.2. Разделение и очистка множественных форм ДНКза

висимых РНКполимераз

1.2.1. Экстракция ферментов.

1.2.2. Разделение форм ДНКзависимых РНКполимераз . .

1.2.3. Очистка ДНКзависимых РНКполимераз
1.3. Свойства ДНКзависимых РНКполимераз.
1.3.1. Оптимальные условия реакции
1.3.2. Зависимость активности от концентрации субстратов .
1.3.3. Действие ингибиторов на ядерные РНКполимеразы
1.4. Субъединичное строение ядерных ДНКзависимых
РНКполимераз
1.4.1. Большие субъединицы .
1.4.2. Мелкие субъединицы.
1.4.2.1. Субъединицы, общие для всех трех классов. . . РНКполимераз
1.4.2.2. Субъединицы, общие для двух классов РНКполимераз .
1.4.3. Субъединицы промежуточного размера.
стр.
Глава П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Культивирование
2.3. Выделение субклеточных структур
2.3.1. Выделение ядер в изотонической среде
2.3.2. Выделение ядер в гипертонической среде .
2.3.3. Выделение ядрышек
2.4. Выделение и очистка ферментов.
2.4.1. Экстракция ферментов из ядер.
2.4.2. Разделение форм РНКполимеразы.
2.4.3. Аффинная хроматография РНКполимераз
2.4.3.1. Синтез аффинных сорбентов
2.4.3.2. Очистка РНКполимераз на аффинных сорбентах
2.4.4. Гельфильтрация РНКполимераз
2.5. Методы получения ДНК.
2.5.1. Выделение ядерной ДНК. .
2.5.2. Получение различных форм ДНК плазмиды рСО
2.5.3. Электрофорез ДНК.
2.6. Определение активностей ферментов
2.6.1. Определение активности ДНКзависимых РНКполимераз .
2.6.2. Определение РНКполимеразной активности субклеточных структур.
2.6.3. Определение нуклеазных активностей
2.7. Определение молекулярной массы белков. .
2.7.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях
2.7.2. Гельфильтрация на колонках с сефакрилом
4
2.7.3. Электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
2.8. Определение содержания белка и ДНК.
Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. РНКполимеразная активность ядер.
3.2. Внутриядерная локализация РНКполимеразных
активностей
3.3. Выделение ДНКзависимых РНКполимераз
3.3.1. Разделение форм ДНКзависимой РНКполимеразы
3.3.2. Аффинная хроматография РНКполимераз.
3.3.3. Очистка РНКполимераз при помощи гельфильтрации .
3.3.4. Очистка РНКполимераз с использованием сефа
крила 0 .
3.4. Свойства ДНКзависимых РНКполимераз.
3.4.1. Влияние матрицы на активность РНКполимераз
3.4.2. Зависимость активности от субстратов
3.5. Структура ДНКзависимых РНКполимераз iii
i.
3.5.1. Размеры молекул ферментов
3.5.2. Субъединичная структура РНКполимераз
ЗАКЛКНЕНИЕ
вывода
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Так, в ядрах печени крысы, преинкубированных мин при и эта активность различалась в 1,5 раза 1. Следует отметить, что Мп2зависимая активность при высокой ионной силе инактивировалась лишь при температуре выше . Различная термоустойчивость подтверждает предположение о наличии в ядрах двух форм фермента. I.I. Как уже упоминалось, РНКполимеразная активность ядер подавляется актино. . Чувствительность к этому антибиотику различна при разных условиях инкубации. В среде с низкой ионной силой в присутствии 2 полное ингибирование достигается при добавлении 0 мкг актиномицина на I мг ДНК, 5С при I мкгмг ДНК. При высокой ионной силе Мп2зависшая активность ингибируется при концентрациях антибиотика на порядок выше 1,. Известно, что актиномицины ингибируют транскрипцию, связываясь с матрицей. Повидимому, при высокой ионной силе происходит удаление части белков из хроматина, что приводит к увеличению числа участков, доступных для актиномицина. Ауринтрикарбоновая кислота, ингибирующая связывание белков с нуклеиновыми кислотами и препятствующая таким образом инициации синтеза РНК, подавляла РНКполимеразную активность ядер животных. Зависимость активности от концентрации ингибитора носила двухфазны Г1 ингибирование составляло , а от 0 до мкМ . Это указывает на наличие двух форм фермента, имеющих различное сродство к матрице 8. Наибольший интерес представляют данные по действию аманитина, бициклического октапептида из бледной поганки i i 2. Этот токсин подавлял РНКполимеразную активность в ядрах животных клеток в присутствии Мп при высокой ионной силе и не действовал на 12зависимую активность при низких концентрациях солей 1,8,2. Ингибирование наблюдалось при крайне низких концентрациях токсина. Полное ингибирование достигалось при 0,2 мкгмл. Столь высокая чувствительность к действию саманитина показана для ядер млекопитающих, земноводных 2, рыб 3, насекомых и высших растений . Ядра из дрожжей отличаются меньшей чувствительностьюзаметное ингибирование происходит при концентрации токсина 0 мкгмл 6. Дифференциальное ингибирование РНКполимеразных активностей, проявляющихся при различных условиях позволило сделать окончательный вывод о наличии в ядрах эукариотов нескольких форм ДНКзависимых РНКполимераз. Экзотоксин из i iii , представляющий собой структурный аналог АТФ, ингибирует РНКполимеразную активность в ядрах печени мыши 7 и крысы . АТФ. Для ингибирования активности, проявляющейся при низкой ионной силе, достаточно 12 мкМ токсина, тогда как при высокой ионной силе подавление активности происходит при 00 мкМ . Аналогичные результаты получены для ядер из насекомых . Но другим данным действие экзотоксина на различные активности одинаково 7. Необычным оказалось действие на РНКполимеразную активность ядер интеркалирующих в ДНК красителей. Как в присутствии Мп2 при высокой ионной силе, так и в присутствии Мп2 при низкой ионной силе, РНКполимеразная активность стимулировалась при концентрациях акрифлавяна ниже 0 мкМ. При более высоких концентрациях красителя наблюдалось ингибирование. Бромистый этидий вызывал аналогичные изменения активности, но ингибирование происходило при более низких концентрациях выше 0 мкМ при низкой ионной силе и выше 0 мкМ при высокой. Экстрагированные из ядер РНКполимеразы ингибировались при всех концентрациях этих красителей, причем полное ингибирование достигалось уке при 0 мкМ красителя, что указывает ка наличие,по крайней мере, двух механизмов действия интеркаляторов ингибирование синтеза РНК и, повид игл ому, изменение структуры хроматиновой матрицы 0. В митохондриях, ДНК которых не входит в состав хроматина, стимуляция синтеза РНК интеркаляторами не происходит. Рифампицин, специфический ингибитор бактериальных РНКполимераз, не действует на активность ядер. Исключение составляют ядра дрозофиллы, РНКполимеразная активность которых частично подавляется этим антибиотиком при невысоких концентрациях солей.