Защитная функция p53 при трансформации фибробластов онкогеном RAS: механизмы и зависимость от происхождения клеток

• Автор: Копнин, Павел Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 150 с. : ил

Оглавление
Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структура и физиологические функции белков семейства

1.1.1. Гены и белки структура, экспрессия, биохимическая активность, регуляция

1.1.2. Эффекторы и регулируемые ими сигнальные пути

1.1.2.1. основной каскад пролиферативной сигнализации

1.1.2.2. РКзависимые пути регуляция пролиферации и жизнеспособности клеток.

1.1.2.3. для i и некоторые другие эффекторы

1.1.2.4. и ГТФазы семейства

1.1.3. Белки в регуляции клеточного цикла.

1.1 Онкогенный потенциал активации белков семейства
1.2.1. Изменения генов в новообразованиях человека
1.2.2. Неопластическая трансформация культур клеток при введении генов
1.2.2.1. Трансформация иммортализованных клеток грызунов роль отдельных эффекторов в возникновении признаков трансформированного фенотипа
1.2.2.2. Трансформации нормальных фибробластов необходимость кооперации с онкогенами, инактивирующими р иили другие опухолевые супрессоры
1.3. Защитные функции опухолевого супрессора р
1.3.1. Введение алгоритм функционирования р
1.3.2. Структура и биохимические активности р.
1.3.3. Физиологические функции р
1.3.3.1. Активация р при различных внутриклеточных нарушениях и стрессах
1.3.3.2. Генымишени р и их роль в контроле клеточного цикла и апоптоза
1.3.4. Нарушения функции р в развитии новообразований человека и
животных.
1.4. Заключение.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Плазмиды и векторы
2.2. Культуры клеток.
2.3. Введение ретровирусных конструкций и получение новых культур
клеток.
2.4. Вестернблоттинг и детекция экспрессии белков.
2.5. Анализ стабильности белка р.
2.6. Нозернблот анализ экспрессии мРНК р
2.7. ОТПЦРанализ и секвенирование
2.8. анализ распределения клеток по фазам клеточного
цикла, включения 5 и экспрессии репортерного белка
2.9. Определение экспрессии репортерного белка .
2 Определение времени удвоения клеточных популяций.
2 Окраска актинового цитоскелета.
Глава 3. Результаты
3.1. Последствия экспрессии онкогена в крысиных фибробластах
линии
3.1.1. Действие онкобелка на клеточный цикл и
пролиферативную способность клеток
3.1.2. Связь остановки пролиферации с активацией р.
3.1.3. Потеря экспрессии и реверсия к нормальному фенотипу в культурах и их связь с активацией р.
3.1.4. Механизмы активации р при экспрессии в клетках
3.1.5. Экспрессия онкогена V, в отличие от инактивацииьгугаций р, недостаточна для индуцированной трансформации клеток
3.2. Отличия в реакции р на гиперэкспрессию онкогена в
крысиных фибробластах линий и i
3.3. Отличия в реакциях человеческих фибробластов различного
происхождения на экспрессию онкогена
Глава 4. Обсуждение
4.1. Механизмы и последствия активации р в экспрессирующих клетках .
4.2. Влияние экспрессии онкобелка сМус на способность онкогена трансформировать клетки .
4.3. Различия в реакциях клеток разного происхождения на экспрессию
в них онкогена
4.3.1. Природа сигналов, вызывающих активацию р при экспрессии онкогена и различия в индукции р в клетках разного происхождения
4.3.2. Пути воздействия на активность 2IIII и различия в реакциях клеток разного происхождения на повышение экспрессии ,.
Выводы.
Список литературы


Белки синтезируются на свободных рибосомах в цитоплазме. Однако функциональную активность они проявляют на внутренней мембране клетки. Для переноса на мембрану необходимо посттрансляционное нренилирование фарнезилироваиие полипептидной цепи. Ключевую роль в этом процессе играет остаток цистеина6 из консервативного СААХмотива на Сконце молекулы. Фарнезилирование белков необходимо для проявления его активности. Ингибиторы фарнсзилтрансфсразы находят применение как инактиваторы функции i, . Белки обладают ГТФазной активностью, то есть катализируют гидролиз ГТФ до ГДФ. При этом их конформация и активность зависит от того, связывают ли они ГТФ или ГДФ. Согласно данным рентгеноструктурного анализа обмен ГДФ на ГТФ приводит к изменению укладки определенных участков белковой молекулы , а именно i районов I аминокислоты и II аминокислоты , . I в основном ответственен за связывание с эффекторными молекулами и ГГФазаактивируюшими белками , i район II за связывание с факторами обмена гуанинового нуклеотида . В ГТФсвязанном состоянии открываются сайты связывания эффекторов , т. Гидролиз ГТФ приводит к обратному изменению конфомации, и связывание эффекторов делается невозможным. Для того чтобы вновь перейти в активное состояние, необходим обмен связанного ГДФ на ГТФ i , . Несмотря на существенно более высокую концентрацию ГТФ по отношению к ГДФ в клетке, большая часть ,7 белков в нормзьных условиях находится в неактивном ГДФсвязанном состоянии. Это обусловлено тем, что присущие белкам константы диссоциации ГДФ достаточно малы 0. Акгивность может репчшроваться двумя способами стимуляция обмена ГДФ на ГТФ играет активирующую роль, а стимуляция ГТФазной активности оказывает ингибирующий эффект. Ферменты, обеспечивающие обмен ГДФ на ГТФ, называются x или i iii i. Семейство включает около представителей си. Кроме того, в обмене ГДФ на ГТФ принимают участие белки , 2 и . Для всех них характерно присутствие т. Сбсдомена по гомологии с нуклеотидным обменником дрожжей . Показана также роль зависимого нитрозилирования в стимуляции нуклеотидного обмена. С другой стороны, в качестве катализаторов ГТФазной активности выступают такие представители семейства белков как , 1, I и др. Следует подчеркнуть, что и 1 являются одновременно и эффекторами за это ответственны их другие домены, что наводит на мысль о регуляции по типу обратной связи i, . Кроме того, роль выключателей играют белкиингибиторы нуклеотидного обмена, например I , . Определенные аминокислотные замены в белковой молекуле приводят к тому, что постоянно находятся в активном ГТФсвязанном состоянии. Такие, т. ГТФазной активности и облегчению обмена ГДФ на ГТФ. Мутации в кодонах , , , и уменьшают ГГФазную активность и делают белок нечувствительным к действию и 1. Например, замена на любую аминокислоту за исключением в положении способствует формированию альфа спиральной структуры 1. ГТФ, что приводит к сильному ослаблению ГТФазной активности. Замены аминокислот в положениях , , 6, 7, 9, 4 и 6 ускоряют скорость обмена гуанинового нуклеотида, также приводя к повышению активности . Общая схема передачи сигналов, в которой участвует , начинается с взаимодействия специфических рецепторов клетки со своими лигандами ростовыми факторами или другими цитокинами. Связывание лиганда приводит к автофоефорилированию рецептора. Далее, с фосфотирозиновыми остатками 2домена 2 рецептора взаимодействует адаптер, например 2 i 2. Адаптор, в свою очередь, через свой 3 домен связывает фактор обмена гуанинового нуклеотида и притягивает его к внутренней поверхности клеточной мембраны, где локализуются белки. ГДФ на ГТФ в молекуле . При этом происходит конформационная перестройка белка , в эффскгорном домене его молекулы открываются сайты взаимодействия с эффекторами, т. I3 iVii , . Первоначально были выделены три важнейших эффектора , и I3. Позднее было найдено множество других потенциальных эффекторов наиболее четкие доказательства получены для i 1, МЕКК1, , РК. С и . Показано также, что некоторые , в частности , повидимому, одновременно способны передавать сигнал вниз от .