Структурно-функциональная организация D-плазмид штаммов рода Raoultella

• Автор: Жарикова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 114 с.

1.1. Плазмиды бактерий

1.2. Организация и эволюция путей катаболизма хлорароматических соединений

1.3. Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

1.4. Ключевые гены и ферменты нижних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

1.5. Плазмида р.1Р4 модельная плазмида дефадации 2,4Д ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Получение чистых культур штаммовдеструкторов

2.3. Идентификация штаммов

2.3.1. Классификация штаммов по культуральноморфологическим и физиологобиохимическим признакам
2.3.2. Определение морфологических и морфометрических характеристик клеток методом электронной микроскопии
2.3.3. Молекулярнобиологическая идентификация штаммов на основе ссквснирования гена Б рРНК
2.3.3.1.Выделение и характеристика суммарной ДНК
2.3.3.2. Амплификация, секвенирование и анализ последовательностей генов Б рРНК
2.4. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет
2.5. Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот
в культуральной жидкости
2.6. Идентификация продуктов метаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот
2.7. Выделение плазмидной ДИК
2.8. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле
2.9. Обработка препаратов плазмид рестриктазами и определение размеров фрагментов ДНК
2 Элиминация плазмид, индуцированная акридиновым оранжевым
2 Определение устойчивости бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам
9 2 Трансформация штаммов
. Приготовление компетентных клеток
. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДК
2 Конъюгация клеток бактерий
2 Гибридизация препаратов ДНК на фильтре
. Получение радиоактивного зонда методом
замещения нуклеотидов
. Иммобилизация плазмидной ДИК на нитроцеллюлозном
фильтре
. Дотблот гибридизация препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре
2 Физикохимические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот 4ХФУК, 2,4Д, 2,4,5Т
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1.Идентификация штаммов 4сЬ, 0 и Т на основе морфологоморфометрических, физиологобиохимических признаков и анализа последовательностей генов Б рРНК
и 3.1.1. Морфологоморфомстричсскис признаки штаммов
3.1.2. Физиологобиохимические признаки штаммов
3.1.3. Диализ последовательностей генов рРНК штаммов
4, и Т
3.2. Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот . i 4, . i и . i в периодической культуре
3.3. Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов . i 4, . i и . i
3.4. Анализ плазмидного статуса клеток штаммов . i 4, . i и . i
3.5. Участие плазмид 4, и в генетическом i контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот
3.6. Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмидах 4, и
3.7. Горизонтальный перенос плазмид 4, и и экспрессия функций катаболизма и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам в других хозяевах
3.8. Дотблот гибридизация препаратов плазмид 4, , и
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот . Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов . Анализ плазмидного статуса клеток штаммов . Актуальность проблемы. Большинство таких соединений опасны для человека и животных, а некоторые из них, например, хлорфеноксиуксусные кислоты, применяемые в качестве пестицидов и гербицидов, используются именно вследствие своей токсичности. Известно, что микробная деградация является основным процессом, приводящим к разрушению сложно утилизируемых соединений в природных условиях. Автономно существуя в бактериальных клеткаххозяевах, плазмиды способны к длительному самоподдержанию, саморегуляции и самовоспроизведению. Конъюгативность или трансмиссивность многих плазмид, заключающаяся в их способности к переходу от одних клетокхозяев к другим, является одним из важнейших свойств этих внехромосомных элементов. До недавнего времени исследования разнообразия молекулярногенетических систем катаболизма хлорфсноксиуксусных кислот касались в основном плазмиды деградации 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты 2,4Д 4 штамма i 4 . Несомненно, что изучение струпурной организации новых Эплазмид, выделенных из природных штаммов, будет способствовать более глубокому пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе возникновения и становления путей биодеградации ксенобиотиков, в том числе, хлорфеноксиуксусных кислот. Кроме того, исследование микробиологических процессов деградации на молекулярном уровне имеет важное экологическое значение с точки зрения возможного целенаправленного использования бактерий и их генетического пула в технологиях очистки окружающей среды нового поколения. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выявление особенностей структурнофункциональной организации плазмидных систем деградации хлорфеноксиуксусных кислот новых природных штаммов бактерий, выделенных из загрязненных биотопов. Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы бактерий, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства. Научная новизна исследования. Д и 2,4,5трихлорфеноксиуксусной 2,4,5Т кислот. Установлено, что последовательности генов рРНК штаммов идентичны и наиболее близки к последовательности типового штамма i. На примере . Д, 2,4,5Т в качестве единственного источника углерода и энергии для представителей рода . Среди метаболитов деградации были выявлены хлорфеноксиуксусная для 2,4Д и 2,4,5Т, феноксиуксусная для 4ХФУК, 2,4Д, 2,4,5Т и 3метил2,6диоксо4гексеновая кислоты для 4ХФУК, 2,4Д, 2,4,5Т. Эти данные свидетельствуют о наличии общего пути деградации этих хлорфеноксиуксусных кислот. Установлено, что процесс деградации хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов . Поэтому плазмиды 4, и были квалифицированы как новые плазмиды деградации или плазмиды. ПОтпн, а для 7 тпн. Выявлено, что на исследованных плазмидах, помимо генов катаболизма хлорфсноксиуксусиых кислот, локализованы детерминанты резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Установлено, что плазмиды 4, и являются конъюгативными и способны экспрессировать катаболические функции деградации хлорированных феноксиуксусных кислот, а также функции резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в другом бактериальном хозяине. Выявлено, что исследованные плазмиды не имеют существенной гомологии с плазмидой деградации 2,4Д 4 i 4. Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают особенности строения молекулярногенетических систем катаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот и вносят существенный вклад в понимание процессов формирования и эволюционирования путей биодеградации ксенобиотиков. Сведения о новых плазмидах расширяет представления о молекулярных механизмах адаптации бактерий к утилизации синтетических субстратов, которые ранее не присутствовали в окружающей среде. Выделенные штаммы и их плазмиды могут быть применены для создания новых штаммовдеструкторов i vi, а также в разработках технологий очистки окружающей среды нового поколения. Апробация работы.