Разработка метода видоспецифичной диагностики ортопоксвирусов, патогенных для человека, на основе использования мультиплексной ПЦР

• Автор: Гаврилова, Елена Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 118 с. : ил.

Появление метода амплификации фрагментов ДНК в полимеразной цепной реакции ПЦР создаю предпосылки к разработке вариантов процедур экспресс идентификации ортопоксвирусов. В настоящее время описано применение ПЦР для детекции ортопоксвирусов с использованием единых олигонуклеотидных праймеров к району генов, кодирующих гемагглютинин, белок тел включения типа А и гомолог рецептора фактора некроза опухолей , . Во всех этих работах полученные после ПЦР фрагменты ДНК гидролизовали определенными рестриктазами и разделяли электрофорезом, что позволяло по картине расположения субфрагментов осуществлять видовую идентификацию ортопоксвирусов. Однако при анализе достаточно большого набора изолятов какоголибо вида ортопоксвирусов, выявлялась их гетерогенность по спектру получающихся субфрагментов, что вносило неоднозначность в трактовку получаемых результатов. На основе полученных в нашем отделе и других лабораториях данных о геномных последовательностях ортопоксвирусов, возникла возможность выявления видоспецифичных районов ДНК этих вирусов и разработки простой и надежной методики одностадийной экспресс идентификации четырех видов ортопоксвирусов, патогенных для человека, основанной на применении мультиплексной полимеразной цепной реакции МПЦР. Цели и задачи исследования. Цель работы Разработка одностадийного метода видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов вирусов натуральной оспы, оспы обезьян, оспы коров, осповакцины на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции. Подобрать олигонуклеотидные праймеры для мультиплексного ПЦР, обеспечивающие ви доспей иф и чную амплификацию ортопоксвирусных ДНК и образующих в МПЦР продукты разной длины, характерные для каждого вида ортопоксвируса. Оптимизировать параметры МПЦР с выбранными олигонуклеотидами. Сконструировать положительный контроль методики МПЦР диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов на основе клонированных специфичных ДНКампликонов. Определить основные аналитические и диагностические характеристики разрабатываемой методики видоспецифичной диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов методом МПЦР. Научная новизна и практическая ценность работы. Обнаружена новая ранее неизвестная открытая рамка трансляции УАЯУподобного района ортопоксвирусов у некоторых штаммов СРХУ. Проведено определение нуклеотидной последовательности и компьютерный анализ данной ОРТ у двух штаммов СРХУ ОРУ1 и ЕР2. Впервые осуществлен выбор олигонуклеотидных праймеров для детекции и дифференциации четырех патогенных для человека видов ортопоксвирусов УАТТУ, МРХУ, СРХУ и УАСУ. Разработан метод видоспецифичной экспресс диагностики ортопоксвирусов патогенных для человека, использующий одностадийный анализ МПЦР, учитывающий вес новейшие данные по структуре генома ортопоксвирусов и проверенный на ДНК штаммов различных видов ортопоксвирусов. Показана эффективность использования МПЦР при анализе клинического материала корочек с кожных поражений людей, болевших в г. ЛИВП УАСУ в г. VV, XV, XV, VV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции. Вклад автора. Поиск и компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей видоспецифичных районов геномов VV, XV, XV и VV выполнен автором при участии И. В. Бабкина. Секвенирование VVподобного района генома двух штаммов XV VV1 и V2 выполнено лично автором. Разработка метода диагностики и конструирование положительного контроля методики МПЦР на основе клонированных специфичных ДНКампликонов выполнены лично автором. Разработка нормативнотехнической документации на метод видоспецифичной экспресс диагностики четырех патогенных для человека ортопоксвирусов VV, XV, XV, VV на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции выполнено лично автором. Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 4го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ Вектор И. В. Бабкиным, М. В. Михеевым и И. Н. Бабкиной. Апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых научных журналах, получен патент РФ.