Структурно-функциональные домены матриксного белка М1 вируса гриппа

• Автор: Тимофеева, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ю

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА ОРТОМИКСОВИРУСОВ ГЛАВА 1. СТРУКТУРА ВИРУСА ГРИППА

1. Геном вируса гриппа А

2. Роль вирусных белков в структурной организации вириона гриппа А

3. Матриксный белок вируса гриппа А как элемент, обеспечивающий целостность вирусной частицы

3.1. Свойства матриксного белка вируса гриппа

3.2. Голь матриксного белка в организации вирусных частиц

3.3. Структура матриксного белка

3.4. Методы выделения матриксного белка М1

4. Особенности структуры вирусов гриппа А, В и С и их матриксных белков ГЛАВА 2. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСА ГРИГ1А
1. Этапы репликации вируса гриппа
2. Роль вирусных белков в процессе репликации вируса гриппа А
3. Роль матриксного белка в процессе репликации вируса гриппа
4. Участие протеаз в репликации вируса гриппа
4.1. Роль протеаз хозяйских клеток в репликации вируса гриппа
4.2. Ингибиторы протеаз в системе вирусного протеолиза
5. Особенности репликации и свойств матриксного белка М1 у вирусов гриппа А,
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Получение и очистка вируса гриппа
1.2. Выделение матриксного белка М1 из вирионов и его очистка
1.3. Расщепление матриксного белка посредством гидролиза муравьиной кислотой
1.4. Разделение гидролитических фрагментов матриксного белка
1.5. Электрофоретический анализ белков
1.6. Количественна оценка полипептидов в элюагах
1.7. Получение антител к 1Чкоицевой области белка М1
1.8. Исследование нротеазасвязывающсй активности
1.9. Иммуноферментное картирование протеазасвязмвающен области молекулы М1
1 Конъюгация апротинина
1 Сорбция апротинина на синтетических мембранах
1 Окраска мембран коллоидным серебром
1 Иммунизация животных
1 Иммуноферментный анализ реактивности сывороток
1 Спотиммуноанализ сывороток
1 Анализ трнпсинсвязывающей активности апротинина
1 Ингибирование трипсинсвязывающей активности апротинина с помощью антител к нему
1 Приготовление малых лецитнновых липосом
1 Мечен не вирусных препаратов атомарным тритием и их последующая характеристика
1 Анализ меченых тритием препаратов
. Анализ меченых тритием вирусных полипептидов
. Анализ меченых тритием липосомных липидов
. Анализ меченых тритием угдеводов
1 Расщепление и разделение М1белка на пептиды лротеолитическим способом и анализ полученных пептидов
. Ферментативный гидролиз трипсином М1белка в водном растворе
. Высокоэффективная жидкостная хроматография в обращенной фазе НРЬС
. Аминокислотный анализ пептидов М1
. Ковалентное связывание М1белка с тиопропилсефарозой 6В
. Расщепление иммобилизованного матриксного белка и разделение его пептидов
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА 2. Г1РОТЕАЗАСВЯЗЫВАЮЩАЯ ОБЛАСТЬ МАТРИКСНОГО БЕЛКА М1 ВИРУСА ГРИППА А
1. Гидролитическое расщепление белка М1 с помощью муравьиной кислоты 2. Исследование взаимодействия с трипсином белка М1 и его гидролитических фрагментов
3. Иммунологическое картирование протсазасвязывающей области молекулы М1 с помощью антител
4. Сходство матриксного белка М1 вируса гриппа А с апротинином
4.1. Сравнение структур белка М1 и апротинина
4.2. Сравнение трипсинсвязывающей активности белка А7 и апротинина
5. Изучение свойств апротинина
5.1. Конъюгирование апротинина
5.2. Адсорбция на синтетических мембранах апротинина и апротинина, конъюгированного глутаровым альдегидом.
5.3. Иммуногенные свойства апротинина
ГЛАВА 3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ МАТРИКСНОГО БЕЛКА М1 ВИРУСОВ ГРИППА В ВИРИОНЕ
1. Поверхностное мечение вирусов гриппа атомами трития и распределение метки в поверхностнолокализованных полипептидах
2. Триптическое расщепление матриксного белка вируса гриппа А и
интрамолекулярное распределение тритиевой метки в молекуле М1
3. Оценка глубины погружения матриксного белка М1 в липидную мембрану внриона
ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика методов фракционирования гидролитических фрагментов матриксного белка М1 с помощью хроматографии на гидрофобных носителях 5 Характеристика протеазасвязывающего домена матриксного белка М1 вируса гриппа А
Структурная роль матриксного белка вируса гриппа в составе вириоиа
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Геном ортомиксовирусов состоит из восьми молекул одноцепочечной негативной I I и имеет суммарную молекулярную массу 5 6 Да , . Все вирусы семейства имеют от семи до десяти главных полипептидов. Вирусы обладают гемагглютинирующей активностью, обусловленной наличием гликопротеинового комплекса поверхностных шипов. Репродукция ортомиксовирусов происходит в ядре и в цитоплазме, а сборка включает этап отпочковывания от плазматической мембраны. При смешанном заражении вирусы этого семейства могут обмениваться сегментами генома. Это явление получило название реассортации сегментов или рекомбинации вирусов гриппа. Вирус гриппа принадлежит к числу патогенных вирусов человека и животных. Грипп и гриппоподобные заболевания являются одними из самых массовых инфекционных болезней. Об их размерах говорит хотя бы тот факг, что по количеству поражаемых людей они превосходят все остальные инфекции вместе взятые Слепушкин, 1. Эпидемические заболевания, вызванные этим вирусом, наносят огромный ущерб трудоспособности населения, вызывают высокую смертность среди детей и стариков. Например, в г. РФ было зарегистрировано ,1 млн. ОРЗ, которые в структуре инфекционных болезней составили ,9 Слепушкин, . Экономические потери на один случай заболевания составляли ,5 экономического ущерба относительно всей суммы потерь от инфекционных заболеваний Слепушкин, . Вирусы гриппа А и В вызывают каждые года эпидемии, а примерно раз в лет резкая антигенная изменчивость антшенный шифт вируса гриппа А обуславливает возникновение пандемий, во время которых поражается от одной грехи до половины всего человечества , . Источником инфекции при гриппе является человек. Обычно происходит прямая воздушнокапельная передача инфекции от больного к здоровому человеку. Однако, возможно распространение гриппа и через инфицированный аэрозолями воздух помещений и предметы обихода, находившиеся в пользовании больного. Интенсивность эпидемического процесса при гриппе во многом зависит от иммунитета популяции к данной разновидности возбудителя. Ввиду высокой изменчивости вирусов гриппа инфицирование этими вирусами в целом не приводит к появлению стойкого иммунитета, а пожизненный иммунитет сохраняется лишь для каждого в отдельности вирусного штамма. Видоспецифический характер иммунитета при гриппе обусловлен значительными различиями в антигенной структуре возбудителей Иванников, Исмагулов, . Вирусы типов А, В и С не стимулируют образования перекрестного иммунитета друг к другу. Вирусы , , вызывают лишь частичный, слабо выраженный типоспецифическии перекрестный иммунитет. Однако, так как не вес индивидуумы псрсболсвают во время вспышки, циркуляция вируса продолжается. Кроме iо, число восприимчивых людей непрерывно пополняется за счет рождающихся и подрастающих детей, а также лиц, постепенно утрачивающих иммунитет Слепушкин, . ГЛАВА 1. СТРУКТУРА ВИРУСА ГРИППА. Вирус гриппа явился первым выявленным патогенным вирусом человека и первым вирусом эукариот, который исследовали количественными генетическими методами , , . Вирусы гриппа подразделяются на типы А, В и С на основании различий в репликации и антигенных свойств внутренних структурных белков. Морфологически вирион гриппа А содержит два структурных элемента внутренний рибонуклеопротеид спиральный нуклеокапсид, составляющий сердцевину вириона, содержащий геномную РНК, и наружную, по форме близкую к сферической, линопротеиновую оболочку, на которой расположены шипы поверхностных гликопротеинов v, Vi, . Однако довольно часто встречаются и не сферические, а протяженные нитевидные, так называемые филаментозные, формы i . В среднем, размер вириона гриппа составляет 0 нм в диаметре. Геном вируса гриппа А. Геном вируса гриппа А, представляет собой одноцепочечную нсгативнонитевую РНК, т. РНК последовательности. Геном сегментирован, и это создает большие возможности для рекомбинации и реассортации вируса гриппа типа А в случае возникновения двойной инфекции i, , что было неоднократно получено в лабораторных и естественных условиях , i, . Восемь сегментов генома вируса гриппа кодируют десять белков один неструктурный и девять структурных.