Роль динеин-динактинового комплекса в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках

• Автор: Жаппарова, Ольга Наилевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Строение микротрубочек.

Динеинзависимый транспорт молекул и органслл по микротрубочкам

Структура динеиндинактинового комплекса.

Участие динеиндинактинового комплекса во внутриклеточном транспорте.

Взаимодействие динеиндинактинового комплекса с микротрубочками

Организация микрогрубочек в клетке.

Нуклеация миктротрубочек на центросоме.

Участие динеина в процессах нуклсации микротрубочек

Заякориванис микротрубочек на центросоме.

Участие динеиндинактинового комплекса в заякоривании микротрубочек на центросоме.
Роль протсинкиназ в регуляции организации микрогрубочек
Строение и функции протеи и киназы
ПЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Молекулярное клонирование
.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестернблоттинг.
Экспрессия в бактериях и аффинная очистка белка
Соосажденис с микротрубочками
Сборка микрогрубочек на центросомах i vi.
Киназная реакция i vi
Получение поликлональной сыворотки.
Антитела.
Культивирование клеток.



Микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Полученные в работе ДКконструкты
Оценка степени радиальности микротрубочек
Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуютеирующая активность
Микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Полученные в работе ДНКконезрукты.
Оценка степени радиальности микротрубочек
Ингибирование линейна, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.
Нокдаун протеинкиназы приводит к хаотизации системы микротрубочек, уменьшению содержания динактина на центросоме и нарушению поляризации аппарата Гольджи на краю раны в моиослос
Субъединица динактинового комплекса белок , является субстратом фосфорилирования i vi.
Фосфорилирование динактина по 7 способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек
Белок экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной МТсвязывающего участка. Изоформы поразному взаимодействуют с микротрубочками А, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная р 0, i локализуется на плюсконцах микротрубочек
Белок , тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ. Изофор.ма IIА доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетах изофор.ма р0С1иеВ экспрессируется повсеместно
Экспрессия изоформы в культивируемых клетках увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и этот белок преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Экспрессия изоформы в культивируемых клетках увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и этот белок преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками МТ, актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток. Интерфазные микротрубочки, как правило, организованы в радиальную систему к периферии они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома и окружающий ее перицентриолярный материал. На центросоме образуются затравки для росга микротрубочек и заякориваются их минусконцы. Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков специализированных, механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам динсинам и кинезинам. Динеины перемещаются но направлению к минусконцу микротрубочки, а кинезины к плюсконцу. Таким образом, радиальная организация микротрубочек обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта. Регуляция активного внутриклеточного транспорта чрезвычайно важна для поддержания жизнеспособности клетки и организма в целом. Однако регуляция работы моторных белков изучена недостаточно. Считается, что основным регулятором активности динеина является динактин. Динактиновый комплекс осуществляет связь динсина с перевозимым грузом и, кроме того, обеспечивает процсссивность мотора за счет одной из своих субъединиц р0Сиес. Белок р0,иа1 взаимодействует одновременно с тубулином и с промежуточной цепыо динсина, помогая удерживать моторный комплекс на микротрубочке. Это должно быть особенно важно при транспорте на протяженные расстояния, например, в случае ретроградного транспорта в аксонах. Однако до сих пор не было получено данных об особенностях регуляции работы динеиндинактинового комплекса в нервных клетках. Наряду с обеспечением внутриклеточного транспорта ли ней ндинакти новый комплекс, вероятно, участвует и в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках и во время митоза. Скопления динсина и динактина обнаруживаются на псптросомс интерфазных клеток и в полюсах веретена митотического деления, а ингибирование динсина и разрушение динактиновогокомплекса приводит к хаотизации микротрубочек и дезорганизации полюсов веретена деления. Однако роль динсиндинактинового комплекса в организации микротрубочек пока исследована недостаточно. Организация микротрубочек зависит от локализации и активности центросомных белков, а регуляция последней может осуществляться с помощью обратимого фосфорилирования. К немногим известным протеинкиназам, регулирующим работу центросомы, относится киназа i i, ассоциированная с микротрубочками. По некоторым данным ингибирование ее активности вызывает хаотизацию микротрубочек, однако ни субстрат, ни сигнальные каскады, через которые она может участвовать в регуляции системы микротрубочек, не были до сих пор идентифицированы. Полученные нами результаты проясняют некоторые особенности взаимодействия динактина с микротрубочками в зависимости от типа тканей, а также предоставляют новые данные о механизме регуляции системы микротрубочек протеинкиназой и о ее участии в других внутриклеточных процессах. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Строение микротрубочек. Микротрубочки представляют собой длинные нсвствящиеся полые нити диаметром нм. Их радиальная или параллельная сеть обеспечивает поддержание формы, создаст упорядоченную систему движений внутриклеточных компонентов интерфазной и митотической клетки. Структурными единицами микротрубочки являются гетеродимеры альфа и бетатубулина, связанные с двумя молекулами ГТФ. ГТФ, связанный с асубъединицей, не подвергается гидролизу, а связанный с р тубулином способен гидролизоваться до ГДФ после полимеризации миктротрубочки. Форма микротрубочек поддерживается латеральными и продольными взаимодействиями между субъединицами тубулина. Продольные взаимодействия формируют протофиламент, в котором мономеры соединены голова к хвосту и альфасубъединицы чередуются с бетасубъединицами.