Структурные исследования новых секреторных белков из обоятельного эпителия крысы

• Автор: Меркулова, Мария Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

1. БЕЛКИ ОБОНЯТЕЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Введение

1.2. Строение органа обоняния наземных позвоночных

1.2.1. Структура и функции слизи обонятельного эпителия

1.3. Белки, участвующие в перирецепториых процессах

1.3.1. Одорантсвязывающие белки

1.3.1.1. Запахсвязывающис свойства ОСБ i vi и их физиологическая роль i viv 1.3.2. Ферменты биотрансформацин

1.4. Белки, принимающие участие в рецепции обонятельного сигнала

1.4.1. Белки, специфичные для ресничек обонятельных рецепторных клеток

1.4.2. Мембранные белки обонятельного эпителия, способные эффективно связывать молекулы одорантов
1.4.3. Семейство генов, кодирующих белки, принадлежащие к классу рецепторов, сопряженных с белками
1.4.4. Рекомбинантные белки, продукты экспрессии генов, кодирующих обонятельные рецепторы позвоночных
1.5. Заключение
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
2.1. Введение
2.2. Определение полной аминокислотной последовательности кДа белка
2.3. Анализ аминокислотной последовательности кДа белка
2.4. Определение полной аминокислотной последовательности кДа белка
2.5. Анализ аминокислотной последовательности кДа белка
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Ферменты
3.1.3. Штаммы . i и плазмидные векторы
3.1.4. Микробиологические среды и буферные растворы
3.1.4.1. Микробиологические среды
3.1.4.2. Буферные растворы для денатурации и иммобилизации ДНК на
нитроцеллюлозных фильтрах
3.1.4.3. Растворы для гибридизации нуклеиновых кислот
3.1.4.4. Растворы для i i гибридизации на тканевых срезах
3.1.4.5. Растворы для выделения плазмиднон ДНК
3.1.4.6. Буферные растворы для ферментов модификации ДНК и РНК
3.1.4.7. Буферные растворы для приготовления компетентных клеток . i
3.1.4.8. Фотографические растворы
3.1.4.9. Другие растворы
3.2. Методы
3.2.1. Протеолиз кДа. белка
3.2.2. Обратно фазовая ВЭЖХ
3.2.3. Определение концсвой аминокислотной последовательности
3.2.4. Массспектрометрический анализ
3.2.5. Приготовление агарозного геля
3.2.6. Выделение ДНК фага X
3.2.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток .i
3.2.8. Рестрикция и картирование фрагментов ДНК
3.2.9. Перенос ДНК на мембрану по методу Саузерна
3.2 Перенос и иммобилизация ДНК фага X на фильтрах
3.2 Перенос и иммобилизация ДНК из .i на нитроцеллюлозных фильтрах
3.2 Никтрансляция ДНК
3.2 Радиоактивное мечение олигодезоксирибонуклеотидных зондов
3.2 Блотгибридизация по Саузерну. Гибридизация i i бактериальных колоний и фаговых бляшек
3.2 Извлечение ДНК из агарозных гелей
3.2 Получение компетентных клеток .i
3.2 Трансформация компетентных клеток .i
3.2 Полимеразная цепная реакция ПЦР
3.2 Клонирование продуктов ПЦР
3.2 Определение нуклеотидных последовательностей по методу Сенгера
3.2 I i гибридизация на тканевых срезах
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Белки, участвующие в перирецепториых процессах
1. Запахсвязывающис свойства ОСБ i vi и их физиологическая роль i viv 1. Штаммы . Буферные растворы для приготовления компетентных клеток . Протеолиз кДа. Выделение плазмидной ДНК из клеток . Перенос и иммобилизация ДНК из . Блотгибридизация по Саузерну. Получение компетентных клеток . Трансформация компетентных клеток . Эпителиальные ткани млекопитающих имеют непосредственный контакт с окружающей средой и больше, чем другие ткани, подвержены ее деструктивному воздействию. Некоторые из этих тканей, в т. В слизи находится множество белков, определяющих ее защитные свойства, это антибактериальные белки, иммуноглобулины, ферменты биотрансформации, включая некоторые ферментыантиоксиданты, защищающие клетки эпителия от повреждений, вызываемых действием активных форм кислорода. Ранее при исследовании белкового состава слизи обонятельного эпителия крысы методом электрофореза было выявлено два новых водорастворимых белковых компонента, имеющих молекулярную массу и кДа соответственно, каждый из которых составлял порядка 2 всех белков обонятельного эпителия. Столь значительное содержание этих белков в слизи предполагало их важную роль в обеспечении нормального функционирования клеток обонятельного эпителия, что послужило основанием для последующего изучения их структуры и свойств. Цель работы состояла в определении и анализе полной первичной структуры и кДа белков. Автор выражает признательность своему научному руководителю, доктору химических наук, профессору В. М. Липкину за внимание к данной работе и помощь в ее проведении, кандидату химических наук Т. М. Шуваевой за внимание к данной работе, помощь в оформлении диссертации и проведение экспериментов по определению частичной аминокислотной последовательности кДа белка, С. В. Новоселову за помощь в проведении i i гибридизации, лабораторию биофизики рецепции Института биофизики клетки РАН за плодотворное сотрудничество, кандидату химических наук Н. С. Быстрову за синтез олнгонуклеотидных зондов, кандидату, химических наук Т. Мурановой, Ю. Ф. Леоновой и Н. И. Хорошиловой за определение Ыконцевых аминокислотных последовательностей пептидов и белков, кандидату химических наук О. В. Соловьевой, кандидату химических наук И. А. Костанян и кандидату химических наук Т. В. Ракитиной за ценные советы в работе. Ощущение запаха у наземных позвоночных обусловлено избирательной и высокочувствительной реакцией специализированных сенсорных клеток на присутствие молекул определенных соединений. В более широком смысле специфические реакции на химические вещества, например гормоны или нейромедиаторы, характерны для многих клеток и тканей. Однако обонятельные сенсорные клетки действуют как экстерорецепторы, их реакции дают важную информацию о внешних стимулах, обрабатываемую особыми участками мозга, которые и отвечают за соответствующие ощущения. Итак, в общем случае, обоняние можно рассматривать как особый вид хеморецепции, специализированный к восприятию летучих веществ, характеризующийся низкими порогами чувствительности, индивидуальным узнаванием стимула, имеющего лишь сигнальное значение. Известно, что практически любое органическое соединение, достаточно летучее для того, чтобы достичь обонятельного эпителия и состоящее из не более чем атомов углерода в некоторых случаях также атомов кислорода, азота и серы способно стимулировать обонятельные рецепторы наземных позвоночных рисЛ 1. Летучие вещества, абсолютно лишенные запаха, очень редки. Кроме того, как правило, чем более гидрофобным является вещество, тем оно более эффективно стимулирует обонятельные рецепторы 1. Таким образом, обонятельная система наземных позвоночных приспособлена к восприятию летучих и, в основном, гидрофобных веществ разнообразной химической природы. Любое вещество, способное активировать обонятельные рецепторы, называют пахучим стимулом сингалом, или одорантом. Для многих пахучих веществ определены пороги обоняния минимальные концентрации веществ, при которых воспринимается их запах рис.