CpG-островки как инструмент поиска новых генов : Клонирование, анализ экспрессии, экзон-интронная структура и хромосомная локализация гена LKLF человека

• Автор: Козырев, Сергей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ ОСТРОВКОВ В

ГЕНОМАХ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ

1.1.1 . островки строение, происхождение и

функциональная роль

1.1.2. Инициация репликации ДНК в островках

1.1.3. Метилирование островков v.

1.2. ОСОБЕННОСТИ ОСТРОВКОВ В ГЕНОМАХ

ПОЗВОНОЧНЫХ.
1.2.1. осгровки в геномах холоднокровных
1.2.2. островки в геномах млекопитающих.
1.2.3. островки в геномах птиц
1.3. ПОИСК НОВЫХ ГЕНОВ И КАРТИРОВАНИЕ
ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ОСТРОВКОВ
1.3.1. Выделение фрагментов ДНК, содержащих островки
1.3.2. картирование генома человека
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Бактериальные нггаммы и плазмидиые векторы
2.1.2. Реактивы
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Выделение геномной ДНК человека.
2.2.2. Пульс электрофорез ДНК.
2.2.3. Трансформация клеток . i плазмидной ДНК
2.2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле и элюция фрагментов ДНК из геля.
2.2.6. Электрофорез ДНК в ПААГ
2.2.7. Получение связующей клонотеки
2.2.8. Отбор индивидуальных рекомбинантных клонов.
2.2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.
2.2 Клонирование кДНК гена человека
2.2 Определение экзон интронной структуры гена человека и клонирование 5 промоторной зоны гена.
2.2 Получение радиоактивно меченного ДНК зонда.
2.2 Блот гибридизация РНК i.
2.2 Определение хромосомной локализации гена
человека.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. КОНСТРУИРОВАНИЕ СВЯЗУЮЩЕЙ ЮТЕКИ И ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ КЛОНОВ.
3.1.1. Разработка нового варианта метода получения
связующих клонотек
3.1.2. Составление банка индивидуальных клонов
3.1.3. Анализ первичной структуры клонов
3.1.4. Определение полиморфизма генов рибосомных
РНК человека.
3.2. КЛОНИРОВАНИЕ, АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ЭКЗОН ИНТРОННОЙ СТРУКТУРЫ
ГЕНА 1К1Г ЧЕЛОВЕКА.
3.2.1. Клонирование кДК гена ИКЬЕ человека и анализ его тканевой экспрессии
3.2.2. Анализ аминокислотной последовательности транскрипционного фактора ЬКЫ7 человека
3.2.3. Определение экзон интронной организации и клонирование промоторного района гена Ы1.Е человека
3.2.4. Хромосомное картирование гена ЬКЕЕ человека.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Наиболее ценными будут геномные карты, на которых локализованы конкретные гены. Широко используемые в настоящее время микросателлитные маркеры не позволяют получать геномные карты, содержащие заметную долю кодирующих нуклеотидных последовательностей. Большинство маркеров, использованных для получения существующих карт геномов животных и человека, анонимны, доля конкретных генов в этих картах обычно не превышает . База данных секвенированных кДНК человека x также малопригодна для картирования генома, так как содержит огромное количество несистематизированных коротких в среднем 0 п. Д1 I. В последнее время интенсивно развиваются методы картирования, использующие различные особенности организации генома, в частности, островки I, i, которые представляют собой короткие 0 2 ООО п. Я и Т полосах метафазных хромосом. У человека больше половины генов ассоциировано с Срв островками, включая все гены домашнего хозяйства и около тканеспецифических генов. В большинстве случаев островки окружают промоторы и несколько первых экзонов гена. Поэтому стратегии картирования, использующие клонотеки СрС островков, имеют определенные преимущества перед другими методами. Вопервых, поскольку каждый СрС островок представлен единичной копией в гаплоидном геноме, то такие клонотеки также будут содержать эквимолярное количество островков, не зависящее от уровня и места экпрессии генов. Репрезентативная клонотека позволит получить информацию о более чем половине генов человека при относительно малом числе проанализированных клонов. Это выгодно отличает этот подход от проектов, использующих кДПК фрагменты для картирования. Вовторых, каждый СрС островок представляет собой фрагмент геномной ДНК и имеет конкретную хромосомную локализацию, тогда как кДПК часто могут кодировать участки, отстоящие друг от друга на десятки и даже сотни тысяч пар нуклеотидов. В третьих, такая клонотека содержит информацию о большинстве промоторов и может упростить процедуру клонирования генов, кодирующих ДНК связывающие белки. Полным аналогом СрС островковых клонотек служат 01 связующие клонотеки, содержащие фрагменты геномной ДНК, окружающие участки узнавания эндонуклеазой рестрикции Иой. Это связано с тем, что, по меньшей мере, всех 01 участков СССССССС локализованы в СрС островках. Несмотря на широкое использование связующих клонотек для поиска генов и картирования хромосом, в методе их получения обнаружены существенные недостатки, приведшие к потере большого числа фрагментов генома человека в указанных клонотеках. ДНК, содержащего ген , анализ его экзон интронной организации и установление хромосомной локализации. Глава 1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИИ СрСОС IРОВКОВ В ГЕНОМАХ ВЫСШИХ ЭУКАРИОТ. СрСостровки строение, происхождение и функциональная роль. Динуклеотид СрС асимметрично распределен но геному позвоночных, образуя дискретные кластеры, размером 0 п. Такие кластеры называют СрС островками, они содержат СС, тогда как в основной части геномной ДНК СС составляют около 3. У млекопитающих СрСостровки локализуются в основном в эухроматине И и Т полосах мегафазных хромосом 1, 4, 5. Происхождение островков связывают с развитием системы метилирования 1К у позвоночных. Высокая сложность геномов у этой группы животных потребовала развития дополнительной системы регуляции экспрессии генов, которая обеспечивала бы уменьшение транскрипционного шума. Такой системой у позвоночных стало метилирование 6. ДНКметилтрансфераза специфически метилирует СрС по пятому атому углерода цитозина. При дезаминировании 5 метилцитозина образуется тимин некомплементарная пара ТС узнается ферментативным комплексом и в случаев восстанавливается исходный цитозин 7. Однако, если ДНК успевает реплицироваться до того, как произойдет репарация, то это приведет к фиксации точковой мутации. Таким образом в процессе эволюции позвоночных была утеряна значительная часть цитозина и динуклеотида СрС.