Протеасомная деградация обратной транскриптазы дикого и лекарственно-устойчивых изоляторов ВИЧ-1 и ее регуляция для целей ДНК-вакцинации

• Автор: Стародубова, Елизавета Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Процесс деградации белков в клетке

2. Убиквитинпротеасомная система деградации белков

2.1. Система убиквитинирования

2.2. Убиквитиннезависимое направление белков в протеасому

2.3. Б протеасома.

2.3.1. Б протеасома

2.3.2. Б регуляторный комплекс или РА0.

2.4. Иммунопротеасома.
2.5. Локализация протеасом в клетке.
2.6. Процессы, регулируемые убиквитинпротеасомной системой.
2.6.1. Транскрипция
2.6.2. Регуляция клеточного цикла
3. Роль процесса деградации белков в представлении антигена в комплексе
с молекулами МНС для узнавания Тклетками
3.1. Представление антигенов в комплексе с МНС класса 1.
3.2. Представление антигенов в комплексе с МНС класса II
4. ДНКвакцины.
4.1. Развитие технологии ДНКвакцин.
4.2. Механизм действия.3
4.3. Факторы, влияющие на индукцию иммунного ответа.
4.4. Стратегии усиления иммунного ответа на ДНКвакцинацию
4.5. Терапевтическое применение ДНКвакцин
4.6. Преимущества использования ДНКвакцин
5. Обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека.
5.1. Роль обратной транскриптазы в жизненном цикле ВИЧ.
5.2. Свойства обратной транскриптазы ВИЧ.
5.3. Лекарственная устойчивость обратной транскриптазы ВИЧ1
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы
2. Методы.
2.1. Культивирование и хранение бактериального штамма
2.2. Культивирование, криоконсервация и хранение клеточной линии
2.3. Трансфекция клеток линии НЕК
2.4. Определение времени полужизни белка методом с импульсным
включением метки риЬесйазе
2.5. Определение времени полужизни белка методом с остановкой трансляции циклогексимидом и последующим иммуноблотингом
суЫоЬехМдесЬазе
2.6. Определение концентрации белка по методу Брэдфорд .
2.7. Клонирование фрагментов ДНК
2.7.1. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной
цепной реакции
2.7.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.7.3. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.7.4. Рестрикционный анализ ДНК
2.7.5. Лигирование фрагментов ДНК
2.7.6. Приготовление компетентных клеток Е.соП
2.7.7. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
2.7.8. Выделение плазмидной ДНК
2.8. Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ.
2.9. Перенос белков из ПААГ на целлюлозную мембрану
2 Иммуноокрашивание мембраны
2 Создание генетических конструкций, использованных в работе
. Векторные молекулы, содержащие ген обратной транскриптазы .
2. Клонирование вектора рС1пеоЮС.
2. Получение векторных молекул, кодирующих белок слияния ОТОДК.
2 Флуоресцентная микроскопия эукариотических клеток.
2 Иммунизация мышей.
2 Иммуноферментный анализ антител в сыворотке крови мышей
2 Выделение спленоцитов из селезенки мыши.
2 Анализ спленоцитов иммунизированных мышей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Экспрессия в культуре клеток обратной транскриптазы дикого и лекарственноустойчивых изолятов ВИЧ1.
1.1. Г енетические конструкции.
1.2. Содержание разных вариантов обратной транскриптазы в клетках
1.3. Внутриклеточная локализация обратной транскриптазы
2. Деградация в клетках обратной транскриптазы ВИЧ1 и ее лекарственно устойчивой формы.
2.1. Определение скорости деградации обратной транскриптазы дикого
и лекарственноустойчивых изолятов ВИЧ1 в клетках.
2.2. Изучение деградации на протеасоме обратной транскриптазы дикого типа и ее лекарственноустойчивых изолятов ВИЧ1
2.3. Оценка участия различных клеточных протеаз в деградации
обратной транскриптазы ВИЧ1.
3. Искусственное усиление протеасомной деградации обратной транскриптазы ВИЧ
3.1. Быстрая протеасомная деградация орнитиндекарбоксилазы в
клетках НЕК3.
3.2. Деградация химерного белка обратная транскриптаза
орнитиндекарбоксилаза
3.2 Дизайн конструкции.
3.2 Время полужизни
3.2 Стабилизация ингибиторами протеасомы.
3.3. Иммунизация мышей ДНКвакцинными конструкциями, несущими
ген обратной транскриптазы ВИЧ1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


До сих пор подобные исследования для обратной транскриптазы ВИЧ не проводились. ВИЧинфекции. Поэтому повышение иммуногенности ДНКвакцины на основе гена обратной транскриптазы как дикого, так и лекарственноустойчивых изолятов ВИЧ представляет большой теоретический и практический интерес. Цель и задачи исследования. ДНКвакцинной конструкции, созданной на основе ее гена. ДНКиммунизации мышей изучить иммуногенность ДНКвакцинной конструкции, созданной на основе гена модифицированной обратной транскриптазы ВИЧ1 с усиленной протеасомной деградацией. Баланс синтеза и деградации белков необходим для нормальной жизнедеятельности клетки. Однако долгое время большее предпочтение отдавалось исследованиям, посвященным синтезу белков его активации и эффективности. В регуляции клеточных процессов образование белка рассматривалось в качестве единственного определяющего фактора, тогда как деградация воспринималась как вспомогательный процесс. В течение многих лет, протеолиз считался неселективным процессом, затрагивающим, в основном, белковый обмен и элиминирование белков с нарушениями. Важность деградации белков как механизма, ответственного за регуляцию содержания белков в клетках, признали только в е годы прошлого века iv, . В настоящее время деградация белков в клетке активно изучается и появляется множество работ, демонстрирующих его роль в различных клеточных процессах iv, . В эукариотической клетке существуют две основные системы протеолиза белков это энодосомлизосомная и АТР и убиквитинзависимая протеасомная системы Рис. В общем случае, в лизосоме деградируют белки, поступившие в клетку экзогенным путем, а на протеасоме эндогенные белки. Лизосомы были открыты в г. Дс Дюв и коллегами, за что он позже был награжден Нобелевской премией v . Лизосомы являются цитоплазматическими органеллами, имеющими кислую среду 4,5 и одинарную мембрану. Они присутствуют во всех типах клеток, за исключением эритроцитов. В лизосомах содержится более пятидесяти ферментов, которые способны разрушать белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Активация ферментов происходит в кислой среде. Лизосомные кислые гиролазы представляют собой различные протеазы, нуклеазы, гликозидазы, сульфотазы и липазы. Рис. Две основные системы деградации белков эукариотической клетки эндосомлизосомная и убиквитинпротеасомная. Преимущественно в лизосоме разрушаются экзогенные белки, а на протеасоме эндогенные белки. По каталитически активному аминокислотному остатку в активном сайте они разделяются на три подгруппы цистеиновые, аспартатные и ссриновые. Субстраты поступают в лизосому при эндоцитозе и автофагии Рис. Бактерии и экзогенные белки при фаго и пиноцитозе захватываются в вакуоли эндосомы, которые затем сливаются с пузырьками, содержащими лизосомные ферменты i, . Затем закисляется, что приводит к активации ферментов, которые расщепляют экзогенный субстрат. Для разрушения органелл клетки макроавтофагии мембрана, отделившаяся от эндоплазматического ретикулума, окружает органеллу и формирует пузырек, который затем сливается с л изосомой . Лизосомой могут захватываться также и некоторые внутриклеточные белки микроавтофагия и разрушаться в ней . Показано, что лизосома играет важную роль в таких клеточных процессах, как презентация эпитопов в составе главного комплекса гистосовместимости класса II, ресорбция в костной ткани, прогрессия опухолей и программированная клеточная смерть i . Большинство белков ядра и цитоплазмы эукариотических клеток деградирует по АТР и убиквитинзависимому протеасомному пути . Первые сообщения об обнаружении АТРзависимой протеазы относятся к концу х гг iv . В конце х годов был выделен комплекс, обладающей АТРзависимой протеолитической активностью . Танака и Голдберг предложили термин протеасома i . В это же время появлялись работы, в которых было описано обнаружение убиквитина i . Гершко и Цихановером было показано, что присоединение молекул убиквитина к белкусубстрату способствует деградации этого субстрата. Был выявлен каскад реакций и ферменты, присоединяющие убиквитин . АТРзависимой протеазой .