Влияние первичной структуры Cro-белка на термодинамические свойства частично-структурированного надмолекулярного состояния

• Автор: Замяткин, Дмитрий Федорович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 119 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II. 1. Сворачивание самоорганизация белков

II. 1.1. Развернутое денатурированное состояние

II. 1.2. Состояние расплавленной глобулы

.3. Тепловая денатурация небольших глобулярных белков

происходит по принципу всеил иничего.

II.4. Промежуточные состояния, наблюдаемые при

денатурации и ренатурации белков.

II.4.1. Кинетические интермедиаты.

II 4.2. Равновесные интермедиаты
II.4.2.1. Равновесные промежуточные состояния, реализующиеся в
процессе тепловой денатурации мультидоменных белков.
II.4.2.2. Промежуточные состояния, возникающие в
процессе тепловой денатурации однодоменных белков
II.5. Сто репрессор бактериофага X. Общие сведения
И.5.1. Характеристика Сго дикого типа и его мутант ных форм
.5.2. Мономерные формы Сго рспрсссора фага X
II.6. Применение сканирующей микрокалориметрии
для изучения энергетики самоорганизации белков
II.6.1. Кооперативная денатурация малых глобулярных белков
принцип всеилиничего.
И.6.2. Многостадийные денатурациониые переходы
мультидоменные белки.
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
III. 1. Материалы и реактивы
III.1.1. Подготовка штаммов суперпродуцентов
III. 1.2. Выделение и очистка исследуемых белков
III. 1.2.1. Выделение и очистка белков V и 6
III. 1.2.2. Выделение и очистка белка Сго
III. 1.2.3. Модификация и расщепление полинептидных цепей
исследуемых белков
III.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
.2.1. Сканирующая микрокпоримегрия
ИГ.2.2. Оптические методы
1.2.3. ЯМРспектроскошя
1.2.4. Гидродинамичекие методы
III.3. Методы анализа калориметрических данных
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
IV .1. Исследование влияния экспериментальных условий на
процесс денатурации Сго.
IV. 1.1. Влияние ионной силы на стабильность конформационных
состояний СгоУС
IV. 1.2. Исследование фрагментов различных форм белка Сго
IV. 1.3. Влияние соли на стабильность надмолекулярного
комплекса, образуемого ВгСЫфрагментом СгоУС
IV.2. Исследование мономерной формы белка Сго
У.2.1. Исследование вторичной структуры Сго тВСт
методом К Дспектроскопии.
IV.2.2. Калориметрические исследования мономерных форм Сго
IV.2.3. Влияние соли на параметры денатурационных
переходов белка Сго шОО
IV.2.4. Исследование денатурации белка Сго пЗО методом
ковалентных сшивок
IV.3. Структурные исследования надмолекулярных комплексов,
образуемых различными формами белка Сго
IV.3.1. Данные о структуре интермедиата, полученные с использованием ИКспектроскопии с Фурьепреобразованием.
IV.3.2. Структурные исследования мономерной формы Сго
У.4. Влияние точечных аминокислотных замен на поверхности
структуры рспрсссора на термодинамику ее денатурации
ГУ.4.1. Исследование влияния стабилизирующей замены
СПбЬ на формирование надмолекулярного комплекса различных форм Сго
У.4.2. Структурные аспекты стабилизирующего влияния
мутаций на нативную структуру
ВЫВОД1
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Последующие структурнотермодинамические соотнесения должны способствовать более детальному пониманию механизмов самоорганизвции белков. Диссертация состоит из двух основных частей. Первая обзор литературы посвящена рассмотрению существующего состояния исследований интермедиатов сворачивания белков и строению и свойствам объекта наших исследований Сго репрессора фага X. Вторая часть экспериментальная содержит описание применявшихся в работе материалов и методов, результаты и их обсуждение, а так же выводы. Владимиру Витальевичу Рогову за всестороннюю помощь и содействие в выполнении работы, а так же благожелательное отношение к автору этих строк. Автор благодарен всем сотрудникам Института белка РАН, оказывавшим помощь в работе, и в особенности Ивану Андреевичу Кашпарову. Огромное спасибо нашим немецким коллегам директору Института биофизической химии при университете им. Гете профессору Хайнцу Рутерьянцу и доктору Хайнцу Фабиану за сотрудничество, техническую и материальную поддержку. Автор гак же благодарит Фонд Хавемана за годовую стипендию, выданную на завершение диссертационной работы и Фонд Дж. Сороса за годовую стипендию соросовского аспиранта. II. 1. Сворачивание самоорганизации белков. Изучение процесса самоорганизации белков является одним из ключевых направлений современной молекулярной биологии. Следующей основополагающей, теперь уже экспериментальной работой стало доказательство возможности сворачивания белка i vi, проведенное Анфинсеном на бычьей рибонуклеазе i, . И эта пространственная аруктура способна образовываться спонтанно, если созданы оптимальные условия для сворачивания или рснатурашш. Вопрос о соотношении между термодинамическими и кинетическими факторами в процессе образования нативной структуры белка до сих пор окончательно не решен. К данному моменту возобладал взгляд, объединяющий кинетический и термодинамический подходы, который сводится к представлению о энергетическом ландшафте, то есть к рассмотрению свободной энергии как функции нескольких координат . А. Эта модель подразумевает многообразие форм переходных состояний, причем по мере приближения укладки цепи к нативной конформации это многообразие должно редуцироваться. Двумерные зависимости свободной энергии от координаты реакции в таком случае можно рассматривать как срез с так называемой энергетической воронки. Рис. I. Схематическое изображение энергетической воронки А и двумерный энергетический профиль реакции денатурации белка Б, где нативное, I промежуточное и О денатурированное состояние. Наличие типичной моноэкспонентной кинетики наблюдается, как правило, лишь у маленьких однодоменных белков. В некоторых случаях профиль может содержать один или более дополнительных минимумов рис. Б. Это связано с тем, что ближайшие конформации иолипептидной цепи, находящиеся ближе к нативной укладке, не обязательно имеют меньшую свободную энергию. Исследование энергетики и, если возможно, структуры промежуточных состояний должно дать ключ к пониманию того, каким образом белок приобретает нативную конформацию. Состояние полностью развернутого клубка практически не достижимо даже при высоких концентрациях денатурантов и, поэтому, не представляет интереса в экспериментальном плане. Кроме того, поскольку некоторые элементы вторичной структуры, а также гидрофобные кластеры способны обратимо образовываться за наносекунды, состояние развернутого клубка не может существовать в равновесных условиях как i vi, так и i viv. В результате, при тепловой денатурации, которая будет рассматриваться в данной работе, образуется денатурированное или развернутое состояние, которое на самом деле представляет собой набор многих конформаций, обладающих определенной упорядоченностью полипептидной цепи и сравнительно небольшим гидродинамическим объемом. Рис 2 Схематическое представление основных конформационных состояний глобулярного белка и переходов между ними. II. Конформации, принадлежащие к развернутому состоянию, имеют следующие основные характеристики Рпуа1оУ, 9.