Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4

• Автор: Летаров, Андрей Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додедилсульфат натрия ИПТГ - изопропил-1-тио-|3-галактозид КДа -килодальтон п.н. - пара нуклеотидов ПААТ - полиакриламидный гель иг - продукт гена
ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭГ - полиэтиленгликоль Трис - трис-гидроксиметиламинометан ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
Оглавление
I Введение
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цель и задачи работы
1.3 Научная новизна и практическая ценность работы
II Обзор литературы
II. 1 Фолдинг белка как вторая половина генетического кода
11.2 Основные закономерности фолдинга
П.2.1 Две гипотезы механизма сворачивания
П.2.1.1 Гипотеза нуклеации и роста
11.2.1.2 Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов
11.3 Молекулярные шапероны

DnaK/DnaJ
П.3.2 GroEL/GroES
11.4 Фолдинг белка и сборка бактериофагов
П.4.1 Бактериофаги и молекулярные шапероны
11.4.2 Фибриллярные белки бактериофагов и их сборка
П.4.3 Фибриллярные белки фага Т4
11.5 Структурные особенности coiled coil
11.5.1 Основные принципы структуры coiled coil
11.5.2 Олигомерность coiled coil
11.5.3 Ориентация цепей в структуре coiled coil
11.5.4 Нарушения периодичности
11.6 Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil
11.7 Фибритин бактериофага Т4
III. Материалы и методы

III. 1 Штаммы бактерий и бактериофага
111.2. Среды для выращивания бактерий
III.3 Выращивание бактериофагов и выделение фаговой ДНК
111.4. Плазмиды и белковые препараты
111.5. Конструирование рекомбинантных плазмид
111.6. Полимеразная цепная реакция
111.7. Приготовление компетентных клеток E
и трансформация плазмидной ДНК
111.8. Экспрессия белков и анализ на растворимость
III. 9. Электрофорез белков и иммуноблот
III. 10. Выделение и очистка белков
III. 1.1. Определение концентрации белка
111.1.2. Ограниченный протеолиз
111.13. Спектроскопия кругового дихроизма
111.14 Определение нуклеотидной последовательности
III. 15. Изучение криорефолдинга
111.16. Дифференциальная сканирующая калориметрия
III.17 Солюбилизация тел включения и рефолдинг белка in vitro
IV Результаты исследования
IV. 1 Исходные предпосылки
IV.2 Неспособность последовательности coiled coil участка фибритина
инициировать тримеризацию и фолдинг
IV.2.1 Получение делеционного мутанта фибритина В, лишённого С-
концевого домена
IV.2.2 Свойства белка NB
IV.2.2.1 Экспрессия, растворимость и очистка
IV.2.2.2 Электрофоретическая подвижность
IV.2.2.3 Чувствительность к трипсинолизу
IV.2.2.4 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое олигомерное состояние

Наиболее протяжённой, из известных сегодня, coiled coil структурой обладает белок NuMA, который играет важную роль в процессе митоза. Белок представляет собой димерный параллельный coiled coil длиной 207 нм, состоящий из 1485 остатков, фланкированный двумя глобулярными доменами [91].
II.5.2 Олигомерностъ coiled coil
Число спиралей в coiled coil определяется в первую очередь характером упаковки аминокислотных остатков в гидрофобном коре суперспирали (поверхность, по которой взаимодействуют отдельные а-спирали). Дело в том, что остатки в положениях and имеют различную геометрию по отношению к остову встречной спирали в да-,три- и тетрамерном coiled coil, поэтому для каждого типа спирали существуют различные предпочтения в типах боковых цепей [88,92]. В димерном coiled coil С„-Ср связь остатка, находящегося в коре, параллельна Са-Са-вектору, образующему дно встречной выемки, в положении а и перпендикулярна в положении d. В тримерном coiled coil оба положения а и d имеют остроугольную геометрию. В тетрамерном coiled coil эта связь перпендикулярна в положении а и параллельна в положении d. Поэтому олигомерностъ coiled coil определяется геометрией боковых цепей остатков, находящихся в позициях а и d. Так, напимер, обнаружено, что при параллельной ориентации векторов Са-Ср боллее предпочтительным является изолейцин, при остроугольной - лейцин, а при перпендикулярной предпочтительнее лейцин и менее всего подходит изолейцин. В работе [92] на основании анализа олигомерности ряда пептидов на основе лейцинового зиппера, но с различными аминокислотными остатками в позициях and были сформулированы правила олигомерности coiled coil. Положение остатков лейцина в позициях d и )3-разветвленных остатков (изолейцин или валин) в позициях а способствуют образованию димеров (по соображениям упаковки). Остатки лейцина в позициях d и аспарагина