Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus

• Автор: Ковалевский, Олег Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. i с микроорганизм, условнопатогенный для человека

1.1. Гемолизины i

1.1.1. Гемолизины, имеющие ферментативный механизм действия

1.1.2. ПОРООБРАЗУЮЩИЕ ГЕМОЛИЗИНЫ

1.2. Регуляция экспрессии генов токсинов В.

1.2.1. Глобальный регулятор

1.2.2. Плейотропный регулятор

1.2.3. II специфичный регулятор гена гемолизина II
1.3. Семейство транскрипционных регуляторов
1.3.1. Т РЕГУЛЯТОР гена устойчивости к тетрациклину
1.3.2. РЕГУЛЯТОР, контролирующий процесс множественной ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
1.3.3. Другие белки семейст ва с известной прос транственной структурой
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы бактерий и нлазмидные векторы
2.1.2. Среды и основные буферы ,
2.1.3. Материалы и реактивы.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Получение компетентных клеток .i
2.2.2. Трансформация компетентных клеток
2.2.3. Проведение реакций модификации ДНК
2.2.4. Выделение лазмидной ДНК
2.2.5. Приготовление олигонуклеотидов
2.2.6. Амплификация ДНК с помощью ПЦР
2.2.7. Сайтнаправленньй мутагенез
2.2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле и агарозе
2.2.9. Очистка белка НьуШ
2.2.9.1. Очистка НьуШ с гистидиновым тэгом по обычной методике
2.2.9.2. Очистка НьуШ с гистидиновым тэгом по модифицированной методике
2.2.9.3. Очистка НьуШ и его мутантных вариантов с отщепляемым тэгом
2.2 Продукция селенометионинового производного белка НьуШ.
2.2 Проверка связывания НьуШ и его мутантов с ДНК
2.2 Аналитическая гельфильтрация
2.2 Аналитическое ультрацентрифугирование
2.2 Химическая сшивка глутаровым альдегидом
2.2 Определение Дгалактозидазной активности
2.2 Приготовление комплексов НьуШ с Д1К для кристаллизации
2.2 Кристаллизация белка НьуШ, его мутантов и комплексов с ДНК
2.2 Сбор дифракционных данных, определение и уточнение структур
2.2 Виртуальный скрининг библиотеки лигандов
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Определение олиг омерной формы НьуШ в растворе
2. Определение олигомерной формы НьуШ. при взаимодействии с оператором
3. Кристаллизация и реитгеноструктурный анализ белка НьуШ.
4. Анализ пространственной структуры белка НьуНИ.
5. Кристаллизация комплекса НьуИЯ и операторной ДНК
6. Улучшение кристаллизационных свойств НьуИЯ с помощью направленного . мутагенеза
7. Мутанты НыНЯ с заменой области л.к. 05 на удлиненный линкер
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


При этом на промоторнооператориом сегменте гена И III образует тройной комплекс с РНКполимсразой и снижает уровень транскрипции гена гемолизина II путем ингибирования изомеризации закрытого промоторного комплекса в открытый i . Следует отметить важность работ по выяснению деталей функционирования транскрипционных регуляторов, контролирующих синтез токсинов . Целью настоящей работы являлось детальное изучение структуры транскрипционного регулятора . е операторной ДНК. Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Научная новизна работы. ., установлено, что белок в растворе и при взаимодействии с ДНК, i vi и i viv существует в виде димера. Впервые получены данные, указывающие на возможное участие стероидных производных в регуляции экспрессии гена гемолизина II, и показана способность мутантного варианта белка семсйства к образованию альтернативного димера. Координаты атомов транскрипционного регулятора и его мутантов, определенные методом рентгеноструктурного анализа, занесены в i коды 2X0, 27 и 23. Практическое значение работы. Определение структуры создаст основу для понимания молекулярной логики регуляции экспрессии гена гемолизина II . II, может оказаться важной для терапии инфекций и пищевых отравлений, вызванных данным микроорганизмом. Выявление неожиданной способности мутанта II образовывать альтернативный димер представляет интерес с фундаментальной точки зрения, для углубления нашего понимания деталей белокбелковых взаимодействий и образования четвертичной структуры белка. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. i широко распространенный в окружающей среде грамиоложительный, аэробный факультативно анаэробный, спорообразующий микроорганизм, условнопатогенный для человека Vi . Способен расти при температурах от до С, оптимум роста между и С. Этот вездесущий микроорганизм живет в почве как сапрофит, но также обнаруживается в пищевых и фармацевтических продуктах. Клетки большинства штаммов В. Этот микроорганизм формирует колонии неправильной формы на твердых средах, использует глюкозу но не арабинозу или ксилозу как источник углерода, гидролизует крахмал и желатин, устойчив к ампициллину и проявляет гемолитическую активность Vi . Способность В. Присугствне этих бактерий изменяет текстуру пищевых продуктов, вызывает появление посторонних запахов и привкуса изза роста вегетативных клеток и выработки токсинов. В конечном итоге, употребление продуктов, в которых присутствует В. , , i . Эти симптомы обычно появляются через несколько часов после употребления зараженной пищи и определяются типом токсинов, продуцируемых бактерией. Бациллы, растущие непосредственно на пищевых продуктах, продуцируют эметический токсин, вызывающий рвоту. Однако во время вегетативного роста в тонком кишечнике клетки . , . Следует заметить, что в некоторых странах до всех пищевых отравлений вызывается именно . i, , в литературе описано несколько случаев отравлений с летальным исходом ii . . Споры . Это было продемонстрировано многочисленными исследованиями по детектированию микробной контаминации продуктов . vi . Вообще говоря, само по себе присутствие . Крамер и Гилберт полагают, что необходимо присутствие, но крайней мере, 5 колонийобразующих единиц одного штамма . i, . При этом следует заметить, что разные штаммы . Различия в вирулентности различных штаммов обусловлены сингезом токсинов различных типов. В итоге, с учетом всех факторов, в настоящее время считается, что количество колонийобразующих единиц . , . Кролю пищевых отравлений некоторые штаммы . Описаны случаи, когда . i, , ii, , i . Патогенные свойства . , . Основными факторами, вызывающими тяжелые пищевые отравления, сопровождающиеся диареей, в настоящее время считаются три энтсротоксина , и Vi .