Гомологическая рекомбинация у эукариот : Особенности гомологических ДНК-трансфераз RAD51 из дрожжей Pichia angusta и водорослей Chlamydomonas reinhardtii

• Автор: Шалгуев, Валерий Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Введение

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Введение

1.2. Гомологическая рекомбинация у прокариот.

1.2.1. Схема гомологической рекомбинации.

1.2.2. Биохимические свойства белка у бактерий

1.2.3. Пространственная структура белка .

1.3. Г омологическая рекомбинация у эукариот.

1.3.1. Схема гомологической рекомбинации у дрожжей . vii.

1.3.2. Три субсемейства белков ГР у дрожжей . vii

1.3.3. Биохимические свойства белка .
1.3.4. Схема гомологической рекомбинации у Н. i
1.3.5. Консервативность нуклеопротеиновых филаментов 5 1 и
1.4. Дрожжи . как объект исследований.
1.5. Водоросли С. iii как объект исследований
1.6. Задачи данного исследования.
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Бактериальные и дрожжевые штаммы
2.2. Приборы и оборудование
2.3. Ферменты и реактивы.
2.3.1. Ферменты
2.3.2. Среды.
2.4. Плазмиды
2.4.1. Выделение плазмидной ДНК
2.4.2. Клонирование и секвенирование гена из .
2.4.3. Конструирование и секвенирование плазмид
2.5. Олигонуклеотиды.
2.6. Выделение, визуализация и определение концентрации белков.
2.6.1. Выделение белка а из . .
2.6.2. Выделение белка из С. iii
2.6.3. Выделение белка 5 i6 из С. iii.
2.6.4. Выделение белков и 5 из . vii
2.6.5. Выделение белка из Е. i.
2.6.6. Визуализация белков методом иммуноблотинга
2.6.7. Определение концентрации белков.
2.7. Тестирование нуклеазной активности в препаратах белков.
2.7.1. ОнДНКэкзонуклеазный тест.
2.7.2. ДнДНКэкзонуклеазный тест.
2.7.3. ДнДНКэндонуклеазный тест.
2.7.4. Геликазный тест.
2.8. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза АТФ, катализируемого белками и
2.8.1. Гидролиз АТФ.
2.8.2. Кинетические параметры гидролиза АТФ
2.8.3. Термодинамические параметры активации гидролиза АТФ.
2.8.4. Термодинамические параметры инактивации гидролиза АТФ.
2.9. Тестирование связывания белка i с онДНК молекулярным биконом
2 Рекомбинационный перенос нитей ДНК i vi.
. Реакция переноса нитей с радиоактивномеченной ДНК
. Реакция переноса нитей с субстратом на основе фага фХ4.
. Реакция замещения нити с флуоресцентномеченной ДНК.
. Анализ кинетических параметров реакции замещения нити ДНК.
2 Тестирование функциональной компенсации дефекта гена в . vii
2 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Исследование рекомбинационных и термодинамических
характеристик белков из дрожжей . и . vii.
3.1. Клонирование и первичная структура гена из .
3.2. Экспрессия и выделение белка Ра из . .
3.3. Гидролиз АТФ, катализируемый белком Ра.
3.3.1. ДНКзависимая скорость гидролиза АТФ
3.3.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность
3.3.3. Стехиометрия связывания белка с онДНК.
3.3.4. Стимуляция онДНКзависимой АТФазной активности белка ъ белками
3.3.5. Сравнение термостабильности белков Ра и
3.3.6. Термозависимость нуклеации
3.3.7. Кинетические параметры гидролиза АТФ
3.3.8. Кооперагивность гидролиза АТФ.
3.3.9. Зависимость гидролиза АТФ от
3.4. Рекомбинационный перенос онДНК, активируемый ,2.
3.4.1. Реакция замещения нити ДНК
3.4.2. Реакция переноса нитей ДНК.
3.5. Анализ функциональной компенсации дефекта гена в дрожжах . vii Глава 4. Изучение рекомбинационных свойств и кинетических параметров белка из микроводоросли iii
4.1. Выделение белков ССг и i из С. iii
4.2. Гидролиз АТФ, катализируемый белками и i6.
4.2.1. Температу рная зависимость скорости гидролиза АТФ.
4.2.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность.
4.2.3. Зависимость скорости гидролиза АТФ от
4.2.4. Стехиометрия взаимодействия белка iи полиТ в
пресинаптическом комплексе
4.2.5. Стабильность пресииаптического комплекса
4.3. Анализ кинетики связывания белка i с онДНК молекулярным
биконом
4.4. Рекомбинационный перенос онДНК i vi, катализируемый
Н8бАТРонДНК
4.4.1. Реакция замещения нити ДНК
4.4.2. Реакция переноса нитей ДНК
Глава 5. Обсуждение
5.1. Термальная адаптационная гипотеза
5.2. Анализ термостабильности белков.0
5.3. Связь скорости гидролиза, катализируемого подобным белком, со сложностью
генома и длиной клеточного цикла3
5.4. Биохимические и рекомбинационные характеристики белка Ра из . . 4
5.5. Биохимические и рекомбинационные характеристики белка из С. iii 4
Глава 6. Выводы 6
Список публикаций по теме диссертации7
Список литерату


Это приводит к образованию крупных хромосомных аберраций и доминантных леталей в половых и соматических клетках. При этом нормальный аллель показывает мощный материнский эффект, спасающий гомозиготпотомков 5л у матерей, гетерозиготных по данной мутации , . Недавние наблюдения выявили резольвазную активность в грубых экстрактах человеческих клеток . То есть ту активность, которая необходима для завершения ГР через разрешение промежуточных рекомбинационных или Холидеевских структур. Оказалось, что эта активность требует неповрежденного интактного белка и его комплексообразующего партнера белка X3. Эти данные позволяют предположить, что принимает прямое участие в конечных стадиях ГР в качестве, если не самой резольвазы, то ее активатора. Одноклеточная зеленая микроводоросль iii это перспективный объект биотехнологии. У этого одноклеточного организма, обладающего хромосомами, уровень гомологичной рекомбинации на три порядка ниже, чем негомологичной рекомбинации. Это явление характерно, скорее, для высших эукариот включая человека. У высших различные повторяющиеся последовательности ДНК занимают большую часть генома. При этом ГР может дестабилизировать структуру генома, и, следовательно, она должна быть не только ослабленной, но и тонко отрегулированной для своевременного функционирования в соответствующем месте и в нужное время. Вторым модельным объектом наших биохимических исследований была одноклеточная зеленая микроводоросль С. К моменту начала наших исследований се система ГР, лежащая в основе рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, была весьма слабо изучена. В последние годы реализуется программа секвенирования генома С. В геноме были выявлены разнообразные нуклеотидные повторы. И было получено объяснение низкого уровня ядерной ГР относительно нсгомологичной рекомбинации. Анализ геномной и библиотек у микроводорослей С. ДНК гена
. В настоящей работе ген был экспрессирован, выделен и очищен его продукт. Были также изучены основные биохимические и рекомбинационные активности белка I . Показано, что белок 5I из С. В нашей работе получено подтверждение консервативности функций белков семейства из разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей . С. iii. Цели и задачи исследования. Целями данной работы являлись демонстрация и анализ основ термостабильности дрожжевого белка из . С. iii. Клонирован ген из термотолерантных дрожжей . Выделен белок Ра. Исследованы рекомбинационные и термодинамические характеристики белков из Р. Выделен белок i6 и С из С iii. Выявлены рекомбинационные характеристики белка 5Ii6. Научная новизна. Впервые клонирован ген 5 из метилотрофных термотолерантных дрожжей ii , способных к выживанию при температуре С. Впервые показано, что белок из . ГР реакцию обмена протяженных молекул ДНК. Впервые показано, что белок С из водорослей С. ДНК. Впервые получены доказательства консервативности функций белков семейства из
разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей . С. iii. Научнопрактическая значимость. Результаты работы показывают сходство механизма ГР у низших и высших эукариот. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов гомологической рекомбинации у различных эукариотических организмов. Теоретические результаты работы могут быть использованы в учебных спецкурсах по молекулярной биологии, читаемых на биологомедицинских факультетах высших учебных заведений. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики Гатчина, г. VIII, IX и X Международных школахконференциях молодых ученых Биология наука XXI века Пущино, г. Международной конференции i 1 Ii i , , г. Политехническом Симпозиуме Молодые ученые промышленности СевероЗападного региона СанктПетербург, Россия, г. Международной конференции iv Ереван, Армения, г, Международной конференции Ii i , , , . Белок обладает биохимическими активностями, необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса. ДНК. Белок из водорослей С. АТФ на он и ДНКтраисферазная активность иуклеопротеинового филамента.