Делекционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека и спектр метилирования генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta 2 в эпителиальных опухолях разных локализаций

• Автор: Логинов, Виталий Игоревич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генысупрсссоры опухолевого роста,

1.2. Современные подходы к поиску новых

1.2.1. Анализ геми и гомозиготных делений. Количественная ПЦР

в режиме реального времени

1.2.2. Поиск участков хромосомы, обладающих способностью подавлять

рост опухоли.

1.2.3. Вычитающая гибридизация как один из альтернативных подходов

к поиску
1.2.4. Применение микропанслсй для поиска генов супрессоров
1.2.5. Методы анализа метилировании промоторных районов геновкандидатов на роль в опухолях.
1.3. Картирование на коротком плече хромосомы 3 критичных районов,
потенциально содержащих гены, связанные с эпителиальными опухолями разных локализаций.
1.3.1. Картирование критичных районов Зр в опухолях ночки.
1.3.2. Картирование критичных районов Зр в опухолях легкого
1.3.3. Картирование критичных районов Зр в опухолях молочной железы
1.3.4. Картирование критичных районов Зр в опухолях женских репродуктивных органов
1.3.5. Критичные участки на Зрплече, общие для эпителиальных опухолей разных локализаций
1.4. Роль метилирования в регулировании активности генов.
1.4.1. островки и ген
1.4.2. Гипометилированис ДНК в опухолях
1.4.3. Гипсрмстилирование ДНК в опухолях.
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов.
1.5. Геныкандидаты на коротком плече хромосомы 3, активность которых
подавляется в опухолях за счет метилирования
1.5.1. Новый генкандидат в области 3рр.3 2
1.5.2. Область 3р.3, район
1.5.2.1. Гснкандидат 1
1.5.2.2. Генкандидат 3.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы
2.2. Сбор материала
2.3. Выделение геномной ДНК нз ткани.
2.4. Анализ потерь гетерозиготност
2.5. Полимеразная цепная реакция.
2.6. Электрофоретическое разделение продукгов амплификации.
2.7. Метнлчувствительный рестриктный анализ МЧРА.
2.8. Бисульфитная модификация геномной ДНК.
2.8.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах
2.9. Мстилспецифичная ПЦР МСП.
2 Бисульфитнос ссквенирование
2 Статистическая обработка результатов.
. Точный критерий Фишера.
. Ранговая корреляции Спирмана.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Картирование критичных районов в области короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях пяти локализаций
3.1.1. Аллельные изменения в полиморфных маркерах Зрплеча в ДНК эпителиальных опухолей.
3.1.2. Аллельные изменения на Зр в образцах рака почки.
3 Аллельные изменения на Зр в образцах рака легкого
3.1.4. Аллельные изменения на Зр в образцах рака молочной железы.
3.1.5. Аллельные изменения на Зр в образцах рака яичников
3.1.6. Аллельные изменения на Зр в образцах рака шейки матки.
3.1.7. Сравнение аллельных изменений на Зр в образцах ДНК эпителиальных опухолей пяти локализаций
3.1.8. Районы наиболее частых аллельных делений в пяти типах эпителиального рака
3.1.9. Корреляция частоты аллельных делений со степенью и стадией анаплазик в опухолях пяти локализаций.
3.1 Подтверждение данных по картированию аллельных изменений на Зрплсчс в опухолях , ВС и СС с помощью Г1ЦР в режиме реального
времени
3.1. Картирование гомозиготных делений методом мультиплексной ПЦР
3.1 Скрининг гомозиготных делений в генах из критичных районов Зр
3.1 Кластеры потенциальных и онкогенов в критичных районах Зр
3.2. Спектр метилирования промоторных районов генов , 3 и
2 в эпителивальных опухолях разной локализации.
3.2.1. Анализ метилирования промоторного района гена методами
МСП и МЧРА в опухолях почки, молочной железы и яичников
3.2.2. Анализ метилирования промоторного района гена i3 в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования.
3.2.3. Анализ метилирования промоторного района гена 2 в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования.
3.2.4. Корреляция уровня метилирования промоторных районов генов , XI3 и 2 со степенью анаплазии и с клинической стадией в опухолях различных локализаций.
3.2.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кнудсон предположил, что у пациентов с наследственной предрасположенностью одна мутация унаследована ими от родителей, а заболевание проявляется после того, как последующая соматическая мутация приводит к делеции или инактивации второго нормального аллеля. В спорадических случаях требуется два соматических события в клетке, последовательно инактивирующих два аллеля, что также приводит к образованию опухоли. Было также показано, что обе необходимые для развития ретинобластомы мутации могут наблюдаться в одном и том же локусе на разных гомологичных хромосомах. В результате эпидемиологических исследований была предложена двухудариая теория развития этого заболевания. Участие геновсупрессоров проявляется в контроле клеточного цикла, роста и регуляции транскрипции, сигналов трансляции и ангиогенезе, однако механизмы возникновения клеточной трансформации, еще до конца не ясны и находятся в процессе активного изучения I . К третьей группе можно отнести гены общего контроля или гены системы репарации ДНК 1, 1, 2, I , повреждение которых приводит к ошибкам репликации фенотип и нестабильности микросателлитных последовательностей ДНК Баранова и Янковский, . Таблица 1. Примеры гсновсупрсссоров опухолевого роста. Транскрипционная регуляция клеточного цикла Рстиноблзстома, остсосаркома. З Смаивающие ДНК факторы транскрипции . АРС 5 Транскрипционная регуляция клеточного цикла регуляция клеточной адгезии iv а Рак толстой, прямой кишок Нотта . Негативная регуляция белков регуляция азной активности 2СОЗ Астроцитома . Регуляция клеточного роста и пролиферации клеток, регуляция тирозинкиназной активности . V Регуляция клеточного цикла . I I6. Участие в передаче опосредоваиных сигналов . Рак толстой и прямой кишок Киселев. Альберте и др. Таблица 1. Продолжение. X3. Серннтреонин киназа . Еi . Регуляция транскрипции и репарации ДНК . Опухоли яичников и молочной железы а. МАР2К4 I7 1. Регуляция дифференцировки клеток, апоптоз . I . Репарация ДНК . Вероятность такого события 1м клеток, при этом реальный шанс возникновения опухоли х, или 1й. При повреждении генов системы репарации скорость мутаций возрастает на три порядка и шанс возникновения опухоли составляет нх, или 1. Действительно, при нарушении генов такого типа скорость мутаций может возрастать на порядки, что, в конечном счете, приводит к инактивации геноврегуляторов клеточного роста и к активации протооикогенов i, . К четвертой группе генов, участвующих в росте и развитии клеток опухолей относят гены, кодирующие теломеразный ферментативный комплекс, поддерживающий размер концевых участков хромосом тсломер Киселев, . При каждом делении клетки происходит укорочение хромосомы, пока размер тсломеры не достигнет определенной критической длины порядка т. Наличие активности теломеразного ферментативного комплекса или просто, активности ферментов теломераз характерно именно для злокачественных опухолей и приводит к постоянному восстановлению размера теломер. В доброкачественных опухолях этот фермент либо не выявляется вовсе, либо частота его обнаружения низка . Теломеразная активность практически отсутствует в подавляющем большинстве нормальных клеток человека, за редким исключением, а именно она выявлена в стволовых клетках крови, в репродуктивных тканях, в некоторых самоподдерживающихся тканях типа кишечного эпителия, кератиноцитах и эндометрия i . Куо . Однако, в тех случаях, когда теломеразная активность выявляется в нормальных клетках, ее уровень существенно ниже, чем в опухолевых. Увеличение экспрессии гена предотвращает репликативное старение в различных клеточных типах, в том числе в фибробластах и эпителиальных клетках, участвует в антиапоптическом действии на ранней стадии процесса, до разрушения митохондрий и активации каспаз . Vii i, . Было предположено, что укорачивание теломер генерирует антипролиферативные сигналы, которые связаны с рзависимым iторможснием, которое наблюдается в стареющих клетках Vii . В поддержку этой гипотезы, . ДНК репарацией, что приводило к торможению роста клеток.