Сравнительный анализ структуры и экспрессии генов hsp70 у видов Dropsophila с различной термальной адаптацией

• Автор: Гарбуз, Давид Григорьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Экспрессия генов теплового шока общие аспекты

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Регуляция экспрессии генов ТШ

1.4. Изменения в аппарате транскрипции и трансляции при ТШ

1.5. Функции БТШ в апоптозе

1.6. Структура и эволюция генов ТП

1.7. БТШ в адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания

1.8. БТШ в медицине и экологии

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1 Линии и виды i
2.1.2. Штаммы . i
2.1.3. Клоны .
2.1.4. Ферменты рестрикции
2.1.5. Олигонуклеотиды для анализа связывания факторов транскрипции с элементами ТШ
2.1.7. Антитела
2.2. Методы
2.2.1. Условия содержания дрозофил
2.2.2. Условия теплового шока
2.2.3. Определение базальной и индуцибельной тсрмоустойчнвости
2.2.4. Включение метионина в белки
2.2.5. Подсчт общего включения мстионина8 в белки
2.2.6. Дискэлектрофорез белков с ДДС по Лэммли
2.2.7. Двумерный электрофорез белков по ОФарреллу
2.2.8. Иммуноблоттинг
2.2.9. Иммунопреципитация
2.2 Очистка белков методом препаративного электрофореза
2.2 Обработка белка модифицированным трипсином для построения пептидных карт
2.2 Анализ связывания факторов транскрипции с элементами ТШ
2.2 Включение радиоактивной метки в ДИК
2.2 Выделение геномной ДНК
2.2 Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
2.2 Электрофорез ДНК
2.2 Перенос и гибридизация по Саузерну
2.2 Определение числа копий гена по Саузерну
2.2 Выделение тотальной РНК
2.2 Электрофорез РНК
2.2 Нозсрнгибридизация
2.2 Получение геномных фаговых библиотек
2.2 Скрининг фаговых геномных библиотек
2.2 Выделение ДНК бактериофага X
2.2 Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов
2.2 Выделение фрагментов ДНК
2.2 Клонирование фрагментов ДНК
2.2 Трансформация компетентных клеток
2.2 Выделение плазмидной ДНК
2.2 Секвенирование ДНК
3. Результаты
3.1. Определение базальной термоустойчивости у видов и линий группы утШ
3.2. Определение индуцированной термоустойчивости у видов и
линий группы ii
3.3. Определение термоустойчивости реципрокных гибридов
А iii и П. i
3.4. Изучение общего белкового синтеза при ТШ у А iii и А i
3.5. Накопление БТШ при тепловом шоке
3.6. Определение кинетики индукции мРНК БТШ
3.7. Исследование ДНКсвязывающей активности ШИ
3.8. Анализ паттерна БТШ и динамики синтеза отдельных групп БТШ методом двумерного электрофореза
3.9. Идентификация белков по молекулярным массам пептидов
ЗЛО. Рестрикционный и Саузсрнанализ генов р А iii
3 Определение числа копий гена Й5 у разных линий А iii и
А i
3 Определение структуры кластера генов Изр А упл и А 1итте1 на основе рекомбинантных фагов X
3 Определение нуклеотидной последовательности генов 1ир и прилежащих участков А 1итте1 и А iii
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
6. Список литературы
Список используемых


При тепловом шоке подавляется сборка малых ядерных рибонукпеопротеидов и, следовательно, сплайсинг премРНК. ТШ, т. Изменяются свойства ферментов протеинкиназ и фосфатаз, регулирующих активность РНКполимеразы II . Изменения в аппарате транскрипции, сплайсинга и трансляции обеспечивают избирательность экспрессии генов ТШ и эффективный блок экспрессии генов, работающих в нормальных условиях, на всех этапах реализации генетической информации. Механизмы этих явлений подробно рассматриваются ниже. Методом электрофоретического разделения радиоактивно меченых белков было установлено, что в клетке синтезируется несколько фракций БТШ с различными молекулярными массами 5, 6. Выяснилось, что фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Таким образом общепринятой стала классификация, основанная на молекулярной массе БТШ. Основные группы представлены белками массой низкомолскулярные БТШ или , БТШ, называемые белками по своим структурнофункциональным особенностям, БТШ, БТШ и 0 0 БТШ0 кДа для обзора см. Каждая группа может включать до нескольких десятков гомологов, обладающих сходными структурнофункциональными свойствами. У некоторых организмов может отсутствовать одна из групп например, у i не обнаружены БТШ0, и тогда их функции выполняют БТШ другой группы. Давно было известно, что БТШ определяют способность клеток адаптироваться к действию высокой температуры до определенного предела, а также других повреждающих факторов. В экспериментах по действию повышенной температуры на клетки выяснилось, что предварительный умеренный ТШ позволяет клеткам в дальнейшем переносить более жсткое тепловое воздействие, без предварительного шока являющееся летальным. Этот феномен получил название индуцируемой термоустойчивости . Ряд экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что индуцируемая термотолерантность развивается за счт накопления БТШ для обзора см. Напротив, ингибирование синтеза БТШ или направленный мутагенез отдельных генов семейства БТШ приводят к снижению термоустойчивости клеток . Мутантные особи с нарушением ответа на ТШ летали погибают при температуре, которая для нормальных особей не является смертельной 6, . При подавлении синтеза белков во время ТШ не происходит восстановления нормальной активности генов 4. Механизм защитного действия БТШ основан на их способности препятствовать денатурации и агрегации белков ,. При тепловом шоке и многих других видах стресса клеточные белки подвергаются денатурации. При этом гидрофобные области белковых молекул, в норме обращенные внутрь их структуры, экспонируются в гидрофильную среду цитоплазмы. Затем белки слипаются друг с другом гидрофобными участками, образуя нерастворимые агрегаты. Это приводит к нарушению функций большинства клеточных систем и гибели клетки. Было показано, что БТШ неспецифнчески взаимодействуют с гидрофобными участками денатурированных белков, способствуя восстановлению их нормальной вторичной и третичной структуры. Диссоциация БТШ и белкового субстрата требует гидролиза ЛТФ, который осуществляется с участием БТШ. Продукт реакции АДФ вновь обменивается на АТФ с участием белковкофакторов см. Помимо БТШ в защите белков от денатурации и восстановлении их нативной структуры участвуют также низкомолекулярные БТШ, БТШ и БТШ 0. БТШ, в особенности БТШ, способны не только предохранять от агрегации денатурированные белки, но и связываться с вновь синтезированными белками, обеспечивая правильное сворачивание полипептидной цепи, а также формирование четвертичных структур и транспорт белков в различные органеллы клетки. Белки, способные к неспецифическому взаимодействию с широким спектром клеточных полипептидов и поддержанию их конформации, получили общее название шапероны от французского спутница, компаньонка. Такая функция присуща не всем БТШ. В их число входят белки, сами по себе не влияющие на конформацию других полипептидов, но модулирующие функцию шаперонов и тоже индуцируемые стрессом. К ним относятся, например, БТШ и БТШ. Ниже приведены данные по структуре и функциям наиболее важных БТШ.