Создание рекомбинантных плазмид, содержащих ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом и изучение экспрессии вирусного белка в про- и эукариотической системах

• Автор: Чубукова, Ольга Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 122 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2. Молекулярная зоогеография, биология, филогения хантавирусов

1.2.1. Зоогеография хантавирусов

1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов

1.3. Вакцины.

1.3.1. Генноинженерные вакцины.

1.3.2. ДНКвакцины. Особенности генетической иммунизации
1.3.3. Способы доставки ДНКвакцин
1.3.4. Возможность модуляции иммунного ответа при ДПКвакцинации
1.3.5. Преимущества ДНКвакцин и возможные ограничения в их применении
1.3.6. Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
Глава 2. Объекты и методы исследований.
2.1. Краткая характеристика объектов исследований
2.2. Выделение и очистка РНК из аутопсийных материалов
2.3. Выделение и очистка тотальной ДИК из мышечной ткани
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.6. Получение одноценочечной ДНК фагмид, пригодной для секвенирования
2.7. Аналитический гельэлсктрофорез ДНК в неденатурирующих
условиях.
2.8 Препаративный гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
2.9. Синтез к ДНК
2 Г 1олимеразная цепная реакция
2 Элюция ДНК из агарозных гелей
2одготовка компетентных клеток.
2 Трансформация компетентных клеток . i плазмидной
2 Секвенирование ДНК.
2 Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Индукция промотора
2 Электрофорез полипептидов . i
2 Твердофазный иммуноферментный анализ.
2 Реактивы и материалы.
2. Составы использованных стандартных растворов
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
3.1. Анализ первичной структуры РНК хантавируса, обнаруженного в органах погибших от ГЛПС больных в республике Башкортостан.
3.2. Создание генноинженерных конструкций, пригодных для репродукции нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС в прокариотической системе
3.3.Иммунизация мышей ДНК плазмиды 3.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой живые аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов и , циркулирующих преимущественно в странах Азии Китае и Южной Корее . , . К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей Vi, . Альтернативой обычным вакцинам, возможно, уже в недалеком будущем, станут ДНКвакцины. Принцип ДНКвакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, к которым необходимо получить иммунный ответ. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных и вирусных патогенов , . В настоящее время, в разных странах активно ведутся исследования, направленные на создание ДНКвакцины для лечения и профилактики ГЛПС. Однако, до введения ДНКвакцин в медицинскую практику необходимо провести длительные эксперименты для того, чтобы подтвердить их эффективность и безопасность. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании первичной структуры РНК хантавируса, возбудителя ГЛПС в Башкортостане в гг. белка хантавируса серотипа , способных к его экспрессии в про и эукариотической системах. Клонирование и секвенирование фрагментов и Мсегментов генома хатавируса, выделенного из органов больных, погибших от ГЛПС. Создание генноинженерной конструкции, содержащей фрагмент сегмента, кодирующего полноразмерный белок хантавируса серотипа и исследование экспрессии данного белка в прокариотической системе на основе штамма X . З и использование ДНК данной плазмиды для иммунизации лабораторных мышей. Исследование иммунного ответа, возникающего в результате инъекции ДИК плазмиды 3 в мышечную ткань лабораторных животных. Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенных исследований нами установлено, что выделенный во время вспышки ГЛПС гг. Республики Башкортостан хантавирусный изолят БЛ9Уфаимеет генетически общее происхождение со штаммом , изолированного из рыжей полевки i в г. Определена первичная структура фрагментов генома хантавирусного изолята Л 9У фа. Создана генноинженерная конструкция на основе клонирующего вектора , включающая в себя ген нуклеокапсидного белка хантавируса серотипа , экспрессия которого регулируется бактериальным промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка хантавируса в . Сконструирована рекомбинантная плазмида 3, содержащая ген нуклеокапсидного белка вируса иод контролем V промотора, на основе эукариотического экспрессирующего вектора 3. Иммунизация лабораторных мышей плазмидой 3 индуцировала в клетках мышечной ткани последних синтез антител к белку . Полученные результаты дополняют и расширяют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, циркулирующего на территории республики Башкортостан и являющегося этиологическим агентом самой крупной вспышки ГЛПС за весь период наблюдения. Созданные плазмидные конструкции, 2 и 3, могут быть использованы в дальнейшем, соответственно, в качестве штаммапродуцента вирусного нуклеокапсидного белка и прототипа ДНКвакцины. Апробация работы. Г оризонты физикохимической биологии Пущино, на V Международной конференции Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, хантавирусный пульмонарный синдром и хантавирусы Лион, . Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и тезисов научных сообщений. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 7 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 2 страницах и содержит рисунков, 3 таблицы.