Исследования структуры архейного фактора инициации трансляции 2

• Автор: Столбоушкина, Елена Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ФАКТОР ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ТИПА СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ

1. Краткая характеристика системы инициации трансляции

у бактерий, архей и эукариот.

2. Фактор инициации трансляции 2 эукариотического типа

2.1. Общая организация молекулы I2

2.2. Взаимодействие I2 с инициаторпой метиопштРНК

и малой рибосомпой субчастицей

2.3. Роль факторов , Л, I2, I3 и I5 в работе 2
2.4. Участие I2 в регуляции трансляции
2.5. мРНКсвязывающие свойства I2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и реагенты.
2. Буферы и среды.
3. Бактериальные штаммы и плазмиды
4. Приборы
5. Методы генной инженерии и микробиологии
5.1. Клонирование генов субъединиц I2.
5.2. Экспрессия клонированных генов
x, 3, , в клетках . i
5.3. Конструирование плазмид для суперпродукции
инициаторных . i и . i в клетках . i.
5.4. Выделение больших количеств плазмидной ДНК.
5.5. Проведение расщетения ДНКрестриктазами.
5.6. Получение компетентных клеток . i
с применением хлористого кальция
5.7. Трансформация клеток . i плазмидной ДНК
6. Биохимические методы.
6.1. Препаративная очистка
6.2. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов
6.3. Препаративное выделение и очистка изолированных субъединиц I2 из клеток иипаммовсуперпродуцентов . i.
6.4. Препаративное выделение и очистка гетеротримера
из клеток шталшовсуперпр оду центов . i.
6.5. Выделение и очистка метиониятРИКсинтетазы . i.
6.6. Получение и очистка фрагментов матричных РНКархей.
6.7. Получение мРНКбелковых комплексов
6.8. Препаративное выделение и очистка инициаторных . i и . i из клеток шталшовсуперпродуцентов.
6.9. Аминоацилирование тРНК
6 Получение и препаративная очистка
I23 комплекса
6 Спектрофотометрическое определение концентраций
белков, нуклеиновых кислот и нуклеотидов.
6 Электрофорез ДНК в геле агарозы
6 Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях
6 Электрофорез в геле агарозы IIбелковых комплексов.
6 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДДС
6 Электрофорез белков в ПА1Г
в иеденатурирующих условиях в кислой среде.
6 Получение кристаллов полноразмерного 2 и кристаллов усубъедипицы в свободной и пуклеотидсвязаниой формах.
6 Кристаллизация I23 комплекса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выделение гстсротримерного фактора I2 и его субъединиц
2. Кристаллизация I2 и исследования его структуры
3. Кристаллизация и исследования структуры и
свойств усубъединицы 2.
4. Получение и кристаллизация тройственного комплекса
тРНКг I23
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, анализ структур I2 в составе различных комплексов выявил дополнительный, ранее никем не обнаруживавшийся, сайт связывания ГТФ на поверхности усубъсдиницы, который согласно проведенным нами экспериментам по конкурентному связыванию может являться местом для взаимодействия 5концевого гуаиозин5трифосфата мРНК. Мы также впервые получили кристаллы тройственного комплекса Мс1тРГ1Кга1Р2ГТФ, что открывает перспективы для структурных исследований этого важнейшего компонента и ициаци и iтсляции. Обзор литературы посвящен структурным и функциональным особенностям второго фактора инициации трансляции эукариотического типа. В начале обзора дана краткая характеристика системы инициации трансляции у бактерий, архей и эукариот. Комплекс событий, предшествующих образованию первой пептидной связи белка, обозначается как стадия инициации или начала трансляции. Инициация это относительно медленная стадия в синтезе белка и является главной точкой приложения механизмов регуляции трансляции. В инициации трансляции принимают участие рибосома, специальный инициаторный кодон мРНК, инициаторная тРНК и белки, называемые факторами инициации. В процессе инициации трансляции можно выделить три основных этапа связывание инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей, взаимодействие малой рибосомной субчастицы с мРНК и узнавание инициирующего кодона, присоединение большой рибосомной субчастицы к преинициаториому комплексу для образования транслирующей рибосомы. Однако между доменами жизни существуют значительные различия в реализации этих этапов рис. Известно, что у бактерий нет строгой очередности при связывании мРНК и инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей, т. РНК может присоединиться первой v, V . , , , . Дело в том, что субчастица бактерий имеет собственное сродство к мРИК и без инициаторной тРНК способна узнавать инициирующий кодом. Это происходит за счет комплементарного спаривания 3концевого участка рибосомной РНК с универсальной полипуриновой нуклеотидной последовательностью мРНК последовательностью ШайнаДальгарно , которая непосредственно соседствует с инициирующим кодоном i , i, . Весь процесс инициации грансляции у бактерий протекает с участием трех факторов инициации 11, I2 и I3 их характеристики даны в таблице 1. Рис. Схемы последовательностей событий в инициации трансляции у бактерий, архей и эукариот. Рисунок взят из iv , с некоторыми изменениями. П2 мономер 1 ТФсвязынающий белок 1 способствует связыванию инициаторной тРНК с Ручастком ЗОЯ субчастицы 2 промотнруст присоединение Я субчастицы к мнициаторному ЗОЯ комплексу 5I2 мономер ГГФсвязывающнй белок промогнруег присоединение субчастнцы к прсинициаторному комплексу I2 ,,у гстсротример ГТФсвязываютнй белок 1 доставляет иницнаторную тРНК в участок субчастицы 2 влияет на точность узнавания кодона 3 регулирует синтез белка аР5В 1Р2 мономер ГТФсвязываютнй белок промогнрует присоединение Я субчастицы к преинициаторному комплексу а1К2 о,р,у стсро гример ГТФсвязывающнй белок 1 доставляет иинциаториую тРИК в Ручасток ЗОЭ субчастицы 2 усубъелннина связ. А1Юкодона 2 опосредованно участвует в отборе инициаторной тРНК 3 препятствует ассоциации рибосомных субчастиц мономер 1 необходим для правильного узнавания кодона а 2 а,р,у,6,с гетеропентамер связывается с е1Р2ГДФ и обеспечивает обмен ГДФ на ГТФ аШ2В а,р,6 считается, что обмен ГДФ на ГГФ в комплексе а КЗ гетеромультимер 6, субъединиц 1 служит площадкой для сборки других факторов сК, е1ПА, еР2, Р4В, Р, е У2К4А К4А мономер АТФсвязываюншй белок функция не установлена факторы группы СЕ4 е1К4Р е4 служи г адаптером для первичного связывания мРНК с Б комплексом Г4А моночтер АТФзавнсимая РНКхеликаза раскручивает элементы вторичной структуры 5области мРНК СК4В и е1Ь4Н мономеры стимулируют работу Р4А К4Е мономер специфически связывается с кэпструктурой является мишенью для регуляции инициации трансляции ск4с мономер является платформой для связывания Р4А, Р4Е и РАВР и мишенью для регуляции инициации трансляции а