Модификация термостабильных ДНК-полимераз для повышения эффективности синтеза ДНК

• Автор: Игнатов, Константин Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 131 с. : ил

Среди важнейших областей применения полимераз можно упомянуть секвенирование ДНК по методу Сенгера 2 и полимеразную цепную реакцию ПЦР 3. Большое значение для этих целей имеют полимеразы, выделенные из термофильных организмов 4, особенно, Тац ДНКполимераза из ТИегтш сщиаИсш УТ1 и Т ДНКполимераза из ТИегтш МеппорИНт НВ8. Несмотря на высокую гомологию идентичность аминокислотных последовательностей , Тая и ДНКполимеразы различаются некоторыми практически важным свойствами. К ним можно отнести способность Тгй полимеразы синтезировать более длинные последовательности ДНК и использовать РНК в качестве матрицы, а также способность Гая полимеразы осуществлять ПЦР с большей специфичностью. В настоящей диссертационной работе представлении результаты исследования различий в свойствах Тая и ТЙ1 ДНКполимераз и их причин. Полученные данные позволили более рационально подайте к использоваию этих ферментов для решения прикладных задач и создали предпосылки для направленной корекции свойств этих полимераз. В результате была создана ДНКполимераза способная высокоспецифично и эффективно осуществлять синтез ДНК на сложных матрицах в ходе секвенирования ДНК по методу Сенгера и ПЦР. Обзор литературы. Обзор литературы. Часть I. Первые ДНКполимеразы были выделены из бактерии . Артуром Корнбергом и названы ДНКполимеразам и I, II, III в порядке их открытия в , и году соответственно 1. Несколько позже было показано присутствие подобных ферментов в клетках эукариот. Как и в бактериях, в эукариотических клетках было обнаружено несколько типов ДНКполимераз, различающихся по своим физикохимическим свойствам и биологической роли5. В настоящее время наименее изученными являются ДНКполимеразы археобактерий. Однако, последние исследования показали, что и они содержат как минимум две различные по своим свойствам и функциям полимеразы 6. Наличие нескольких типов полимераз в одной клетке связано с участием этих ферментов в различных процессах жизнедеятельности. Важнейшими из них являются процессы репликации и репарации генетического материала. Полимеразы, вовлеченные в эти процессы, можно разделить по их биологической роли на репликационные и репарационные. ДНКполимеразы можно классифицировать, исходя из классификации организмов, откуда они были выделены. В настоящее время все живое разделяют на три крупных группы , i и 7. Однако, механизмы реализации таких процессов, как транскрипция, трансляция и репликация, у них различны 6. ДНКполимеразы на эукариотические, бактериальные и полимеразы археобактерий. В зависимости от используемой матрицы ДНКполимеразы разделяют на ДНКзависимые и РНК зависимые. Часто ДНКполимеразы подразделяют на термостабильные способные выдерживать температуру близкую к температуре кипения воды, и нстермостабильные. Первые выделяют из экстремальных термофилов организмов, живущих при высоких температурах в гейзерах, вулканах и т. Данное деление связано с широким использование полимераз в исследовательской практике, и не отражает структуру, функции или какиелибо другие свойства фермента, кроме термостабильности. Пожалуй, наиболее универсальной и полезной для практического использования является классификация, основанная на знаниях о структурнофункциональной организации ДНКполимераз. Основываясь на сопоставлении аминокислотных последовательностей 8 и данных рентгеноструктурного анализа 9 различных типов полимераз, все известные на сегодняшний день полимеразы можно разделить на шесть основных семейств. Полимеразы относящиеся к одному семейству проявляют заметную гомологию на уровне первичной, вторичной и третичной структуры, а белки из разных семейств проявляют значительное сходство только на уровне пространственной организации полимеразного домена. Подробнее о структурной организации полимеразного домена ДНКполимераз будет рассказано в следующем разделе обзора. Следует отметить, что структурная классификация ДНКполимераз отражает их филогенетическую близость. Биологические функции полимераз, относящихся к одному семейству, могут значительно различаться.