Вируснейтрализующие рекомбинантные антитела против вируса клещевого энцефалита

• Автор: Леванов, Лев Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вирус клещевого энцефалита.

1.1.1. Таксономия и строение вируса.

1.1.2. Строение и свойства структурных белков вируса КЭ.

1.1.3. Строение и свойства неструктурных белков вируса КЭ.

1.1.4. Жизненный цикл вируса клещевого энцефалита.

1.1.5. Профилактика клещевого энцефалита

1.2. Структура и свойства антител.
1.2.1. Общий план строения антител
1.2.2. Инженерия антител
1.2.3. Механизмы нейтрализации вирусной инфекцмонности антителами.
1.2.4. Механизмы нейтрализации флавивирусной ипфекциопностн антителами.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Растворы.
2.1.3. Ферменты.
2.1.4. Культуральные среды
2.1.5. Эукариотические клетки и бактерии
2.1.6. Вирусы и рекомбинантные белки
2.1.7. Плазмиды.
2.1.8. Используемые олигонуклеотиды.
2.2. МЕТОДЫ.
2.2.1. Выделение суммарной II из гибридомных клеток.
2.2.2. Синтез кДНК и амплификация генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов мыши.
2.2.3. Ферментативный гидролиз ДНК
2.2.4. Элюция фрагментов ДИК
2.2.5. Встраивание фрагментов ДНК в векторную плазмиду
2.2.6. Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов мыши
2.2.7. Электрофоретическое фракционирование ДИК.
2.2.8. Трансформация клеток . i нлазмпдпой ДНК
2.2.9. Выделение плазмидной ДИК из клеток . i.
2.2 Приготовление субклеточных фракций . i
2.2 Очистка одноцепочечных антител.
2.2 Трансфекции эукариотических клеток плазмидными ДНК
2.2 Очистка химерных антител с помощью аффинной хроматографии.
2.2 Электрофоретический анализ белков
2.2 Вестсрнблот анализ
2.2 Иммуноферментный анализ
2.2 Определение констант аффинности одноценочсчных антител в растворе
2.2 Определение гетерофазных констант аффинности одноцепочечных, моноклональных и химерных антител.
2.2 Исследование вируенейтрализуюшей активности
рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибирования фокусообразовании на монослос эукариотических клеток Уего Е6.
2.2 Исследование вируенейтрализуюшей активности рекомбинантных антител против вируса КЭ в реакции ингибирования бляшкообразованин на монослое эукариотических клеток СПЭВ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Получение генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых
и легких цепей моноклональных антител 6 и С2.
3.2. Конструирование рекомбинантных плазмид, кодирующих одноцепочечные антитела против вируса клещевого энцефалита
3.3. Экспрессия генов одноцепочечных антител в клетках . i
3.4. Оценка специфичности одноцепочечных антител в составе клеточных лизатов.
3.5. Очистка одноцепочечных антител.
3.6. Определение констант аффинности и
3.7. Исследование вируснейтралнзующих свойств одноцепочечных антител.
3.8. Конструирование химерных антител против вируса клещевого энцефалита
3.9. Экспрессия генов химерных антител в клетках НЕК 3Т.
3 Исследование иммунохимических свойств полученных химерных антител
3 Исследование вируснейтралнзующих свойств химерных антител.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Создание человеческих гибридом затрудняется изза сложности получения иммунных лимфоцитов, отсутствия подходящих миеломпых клеточных линий, низкой эффективности гибридизации и нестабильности образующихся гибридных клеток. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммупогенности мышиных МКА путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека. В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают химерные антитела. Технология получения химерных антител относительна проста и экономически выгодна, а терапевтический эффект достаточно высок. Именно поэтому в списке рекомбинантных антител, одобренных и разрешенных для терапевтических целей, подавляющее количество антител являются химерными. На сегодняшний день в клинике используются следующие препараты химерных антител ixi iIIII, i i для лечения сердечнососудистых заболеваний, ixi ix I i, iI для лечения больных неходжкинскими лимфомами, iixi i I ix, для лечения ревматоидных артритов и болезни Крона, iixi i I i, vi в трансплантологии при отторжении трансплантата, xi ix I i, I для лечения рака прямой кишки vi, , , , , . Кроме того, значительное количество химерных антител находится на стадии клинических испытаний С5 I iрецептор, I для лечения раковых заболеваний, I i, i I. X I i , i для профилактики кариеса vi. К настоящему времени получены химерные антитела против ряда вирусных патогенов вируса иммунодефицита человека ВИЧ . В , , , С , и Е , , вируса Vi , . Показано, что химерные ангигсла могут осуществлять протекцию и нейтрализацию вирусных агентов . Современная эпидемическая ситуация в некоторых регионах Сибири и Дальнего Востока в отношении КЭ характеризуется значительным ростом заболевасмос и Локтев, . Эта закономерность характерна не только для этих регионов России, где регистрируется большая часть случаев заболеваний, но и для многих европейских стран. В настоящее время единственным специфическим средством лечения этого заболевания является гаммаглобулин против вируса КЭ, получаемый из крови иммунизированных людей. Высокая стоимость данного препарата, его дефицит и возможный риск при его применении делают необходимым поиск альтернативных терапевтических средств. Таким альтернативным средством могли бы стать впруснейтрализующие химерные антитела против вируса КЭ. Цслыо данной работы являлось получение вируснетрализующих химерных и одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита и исследование их свойств. V н легких V. Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей рабоiс впервые скопе фуированы рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие продукцию вируснсйтрализующих химерных и одноцепочечных антител прошв вируса клещевого энцефалита в эукариотических клетках и в клетках Е. Показано, что одноцепочечное антитело и химерное антитело способны ингибировать иифекционноегь вируса КЭ в культуре эукариотических клеток. Определены концентрации ингибирования вирусной инфекционности для одноцепочечного и химерною антител и в реакциях ингибирования фокусообразования на монослое эукариотических клегок V 6 и в реакции ингибирования бляшкообразования на монослое эукариотических клеток СПЭВ. Исследованы иммунохимичсские свойства одноцепочечных и химерных антител. С помошыо методов иммуноферментного анализа определены константы аффинности полученных рекомбинантных одноцепочечных и химерных антител. В ходе данной работы впервые были получены химерные антитела против вируса клещевого энцефалита, обладающие вируснептрализующими свойствами. Полученные антитела после проверки их терапевтических свойств могли бы стать основой щя разработки препарата для лечения клещевого энцефалита. Получен стабильный штаммпродуцент растворимых вируснейтрализующиходноцепочечных антител против вируса КЭ. ФГУ1Т ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 8 Международных конференциях 7 v i I i I ii Москва, Россия, . Ii i i i i Гейдельберг, Германия, , 8 v i I I vi ii Москва, Россия, , Г1 Ii I БерлииГ1огодам, Германия, , Ii i i , Польша.