Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli

• Автор: Скосырев, Виталий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Саркотоксин I

1.1.1. Саркотоксин I представитель семейства цекропинов

1.1.2. Структура и физические свойства пептида

1.1.3. Биологическая роль и механизм действия пептида

1.1.4. Синтез и выделение пептида

1.2. Гибридные белки

1.2.1. Структура гибридного белка

1.2.2. Регуляция уровня экспрессии рекомбинантного белка в клетках
ii i
1.3. Зеленый флуоресцентный белок
1.3.1. Структура белка и образование хромофора
1.3.2. Мутантные варианты и их спектрофотометрические свойства
1.3.3. Физикохимические свойства белка
1.3.4. Экспрессия
1.3.5. Выделение
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II. 1. Материалы
II.2. Методы исследования
.2.1. Создание генноинженерных конструкций
.2.2. Продукция гибридных белков в клетках . i
.2.3. Выделение, рснатурация и очистка гибридных белков
.2.4. Определение функциональной активности и количества продукта
.2.5. Ограниченный протеолиз
.2.6. Иммуноблотннг
.2.7. Аминокислотный и массспектрометрический анализ пептидов
.2.8. Синтез гибридного белка i vi
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность
гибридного белка i viv и i vi
III. 1.1. Изучение процесса протеолитической деградации i vi
III. 1.2. Изучение процесса протеолитической деградации i viv
III.2. Изучение влияния свойств белкапартнера и положения целевого
пептида на синтез полноразмерного гибрида
1.2.1. ГлутатионБтрансфераза саркотоксин
1.2.2. Саркотоксин обелин
1.2.3. Зеленый флуоресцентный белок саркотоксин
1.3. Разработка метода выделения низкомолекулярных полипептидов
в составе гибридных белков на основе
1.3.1. Создание и синтез гибридных белков в клетках . i
1.3.2. Выделение
Ш.3.3. Выделение , и
1.4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина I из
клеток . i
1.4.1. Синтез рекомбинантного саркотоксина i vi
1.4.2. Очистка и характеристика рскомбинашного саркотоксина
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Цскропины небольшие положительно заряженные пептиды, проявляющие высокую антибактериальную активность против грамотрицательных бактерий, включая клетки ii i и i 4. Подобные пептиды были найдены в гемолимфе различных видов чешуекрылых i и двукрылых i 3. Введение суспензии клеток ii i в брюшную полость личинок мух i мясная муха также приводит к индукции синтеза антибактериальных пептидов 5. Физические характеристики молекулярный вес и аминокислотный состав одного из очищенных пептидов гемолимфы саркотоксин были близки характеристикам, свойственным цекронинам, подтверждая, что выделенные пептиды имеют общего предка 2, 6. Подтверждением этого служит высокая степень гомологии саркотокснна I к пептидам данного семейства рис. Рис. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности саркотоксина 1А и цскропннов. Стрелкой указаны высоко консервативные последовательности саркотоксина 1Л и цскроиинов. Саркотоксин I типичный представитель линейных полнкатионных пептидов. Термоустойчив. Состоит из аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу Да рис. Хотя выделенный из гемолимфы пептид на акриламидпом геле при денатурирующих и нативных условиях представлен единственной полосой 6, ВЭЖХ анализ позволил различить три независимых пептидных компонента, получивших название 1А, 1В и 1С согласно порядку элюиии с колонки . Количественное соотношение пептидов сохраняется независимо от способа их выделения. Саркотоксин 1В является основным компонентом смеси. Саркотоксин 1А и саркотоксин 1С составляют соответственно 23 и 13 части саркотоксина ГО. Равные по функциональной активности пептиды ГО и 1А вдвое превышают активность саркотоксина 1С, что объясняется минорными отличиями в функциональной области пептида рис. Эти отличия вызваны единственной заменой нуклеотида во втором или третьем положении кодона. В результате анализа аминокислотной последовательности было обнаружено, что саркотоксин 1А состоит из двух доменов. ЛГконцевой домен 1 а. Сконцевой домен молекулы а. Анализ аминокислотной последовательности по методу Хоппа и Вуда 7 показал, что Лконцевой домен пептида обладает гидрофильными свойствами, а Скоицевой гидрофобными рис. Каждый домен имеет уникальную структуру. I . . Первичная структура рекомбинантного саркотоксина I. I, I, I разновидности саркотокснна I. Дефисом обозначены идентичные ты. Аминокислотные последовательности, образующие аспиралн, выделены прозрачными прямоугольниками схспирали ix 1, ix 2. Серым прямоугольником выделена последовательность, подверженная протсолитичсской деградации в составе гибридного белка i см. Результаты и обсуждение. Удаление Лконцевого глицина и триптофана выделены черным цветом ведет к потере антибактериальной активности. Удаление или замена аминокислотных остатков, выделенных темносерым цветом, в значительной степени влияет на антибактериальную активность пептида. Положительно заряженные аминокислоты обозначены символом . Символом обозначен аминокислотный остаток, отсутствующий в природном саркотоксине. Рис. Профиль гидрофильности саркотоксина А. Профиль получен в результате усреднения величины гидрофильности шестичленных пептидов по методу Хоппа и Вуда. Гидрофильный участок пептида выделен синим, а гидрофобный участок красным цветом. Структура Сконцевого домена по длине и гидрофобности подобна трансмембранным участкам или сигнальным пептидам известных белков 8, 9. Саркотоксин I в органических растворах метанола, этанола или водном растворе лизофосфатидилхолина, имитирующем гидрофобное мембраноподобное окружение имеет упорядоченную структуру рис. Напротив, в водном растворе пептид лишен структуры . В структурированном виде саркотоксин содержит две аспирали 2i и 2vi Рис. Схематическое изображение пространственной структуры саркотоксина I. Структура была определена с помощью программы I . IX 1 и IX 2. Длина второй спирали вдвое короче и равна 0 нм .