Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1

• Автор: Карпенко, Лариса Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 255 с. : ил.

1. Исследовать возможности корового белка вируса гепатита В в качестве носителя эпитопов чужеродных белков. Выбрать оптимальное место встройки чужеродных эпитопов, решить проблему самосборки химерных молекул корового белка.
2. Получить экспериментальную вакцину против гепатита В на основе химерного , несущего основные иммуногенные области I основной иммуногенный эпитоп а, районы и 2. Исследовать специфическую активность созданных конструкций.
3. Оценить иммунный ответ при мукозальной иммунизации экспериментальных животных аттенуированными штаммами сальмонелл, продуцирующими и штаммами, несущими ДНКвакцину против гепатита В.
4. Исследовать возможности доставки полиэпитопного белка I с помощью вирусоподобных частиц ВПЧ и рекомбинантных штаммов сальмонелл.
5. Исследовать возможности доставки ДНКвакцины, кодирующей ген I I с помощью ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.
6. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины КомбиВИЧвак инъекционная форма.
7. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины против ВИЧ1 СалВИЧД суппозиториая форма.

Научная новизна и практическая значимость работы

Продемонстрированы новые возможности как носителя чужеродных антигенных детерминант.

Впервые получен набор химерных частиц , несущих эпитопы . 2 и основной эпитоп а поверхностного белка вируса гепатита В, и исследованы иммуногенные свойства полученных конструкций
Впервые предложен и разработан метод получения мозаичных вирусоподобных частиц на основе с использованием системы векторов, обеспечивающих одновременный синтез химерного и нативного коровою белка вируса гепатита В в одной бактериальной клетке.
Впервые показано, что при рсклалыюй иммунизации рекомбинантный штамм сальмонеллы, несущий вирусный антиген в формате ДНКвакцины, эффективно стимулирует вирусспецифический иммунный ответ. Это продемонстрировано на примере химерных антигенов ВГВ и ВИЧ1 с использованием аттенуированных штаммов iiii Е и ii .
Впервые предложена суппозиториая форма для перректальной иммунизации, обеспечивающая сохранность живых бактериальных клеток, и на ее основе создана экспериментальная вакцина прошв ВИЧ1 СалВИЧ Д. Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что СалВИЧ Д индуцирует ВИЧспецифический гуморальный и клеточный. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Впервые продемонстрирована эффективность доставки полиэнитоиного антигена в виде вирусоподобных частиц, сконструированных на основе рсополиглюкима. Показано, что представление иммунной системе белка I в составе ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа на белок ТВ1 и вызывает адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.
Предложен новый подход конструирования вакцин против вирусов, основанный на объединении в одной конструкции двух иммуногенов один в виде белка, другой в виде ДНК вакцины. На основе данного подхода создана экспериментальная вакцина против ВИЧ1 КомбиВИЧвак инъекционная форма. Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что КомбиВИЧвак индуцирует ВИЧснсцифичсский гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных
длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Вакцины СалВИЧ Д и КомбиВИЧвак и их компоненты защищены патентами РФ. Оформлена НТД на вышеуказанные вакцины, проведена предварительная регистрация в Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. В настоящее время вышеперечисленные вакцины находятся на экспертизе в ГИСК им. Л.А. Тарасовича.
Положения, выносимые на защиту
1. Область основной антигенной детерминанты с корового белка вируса гепатита В НВсАд является перспективной для встроек чужеродных эпитопов.
2. Физикохимические свойства а.о. входящих в состав пептидов гидрофобность, объем и склонность к образованию 3структур, встраиваемых в область с1 НВсА оказываю влияние на способность химерною НВсА к самосборке.
3. Техника получения мозаичных структур или введение фланкирующих цистсинов во встраиваемый пептид позволяет нивелировать отрицательное влияние встроек на самосборку химерных белков, получаемых на основе ВсА9.
4. может выступать носителем имитаторов чужеродных вирусных эпитопов.
5. Химерные коровыс белки НВсЛдНВя, НВсрге и НВсрге собираются в вирусоподобные частицы, обладают антиген костью ВГВ, индуцируют синтез антител к встроенным эпитопам и формируют в организме животных клеточный иммунный ответ, сравнимый с ответом на НВсЛ
6. Рекомбинантный аттенуированный штамм 8а1топеа еШепИсИз БрКНВс, продуцирующий НВсА при ректальной иммунизации мышей линии Ва1Ьс стимулирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ к НВсА.
7. ДНКвакцина, содержащая ген НВсА, индуцирует гуморальный иммунный ответ и клеточное звено иммунитета.
8. Искусственные вирусоподобные частицы ВПЧ, полученные на основе реополиглюкина и экспонирующие на своей поверхности полиэпитолиый белок С8ТТВ1, обладают высокой иммуногснностыо.
9. Рекомбинантные штаммы й.фрЫтигшт рСЕХТВ1 и еШепИсН.ч ЕрСЕХТВ1, продуцирующие белок ТВ1, индуцируют системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ1 при перректальной иммунизации лабораторных животных
. Интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду голая ДНКвакцина, ДНКвакцина в составе ВПЧ ВПЧрсОТСЛ, рекомбинантная сальмонелла 5. урЫтипит рс1ЖАТС1.
. Экспериментальные вакцины КомбиВИЧвак и СазВИЧ Д индуцируют ВИЧспецифический гуморальный и клеточный ответ. Вакцины не вызываю негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях СПИД, рак и родственные проблемы, г., СанктПетербург Россия v i i, . , , , i, i vi, . i, Ii Vi, , Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов, г., Томск, Россия Ii i IV i ii i, , i ii ii i v vi, , vi v, , Вакцинология , Москва и на ряде других конференций.
Работа выполнена в годах в ФГУН ГНИ, ВБ Вектор Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам государственных научнотехнических программ, Новейшие методы биоинженерии, Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел Защита от патогенов, по Федеральной Государственной программе Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего. На разных этапах се выполнения в ней приняли участие Т. А. Веремейко и Н. А. Некрасова, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ. По материалам диссертации получено патентов Российской Федерации, опубликовано статьи.
Часть II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Введение


При применении данной вакцины для новорожденных достигается уровень ссроконверсии , v . Были выявлены факторы, снижающие эффективность вакцинации возраст старше лет, избыточный вес и курение . Важным показателем является не только процент лиц, у которых была выявлена сероконверсия, но и титр антител к . Еще в работах по вакцинации препаратами, приготовленными из сывороток крови носителей ВГВ, было показано, что протсктивным является титр антител порядка , . Надо отметить, что с течением времени после вакцинации титр антител неизбежно падает. И если изначально он составлял 0 , то снижение титра антител в десять раз происходит в течение первого года после вакцинации, а через 4 iода титр антител уменьшается в сто раз i . Клинические исследования, проводимые разными авторами, дают различающиеся средние результаты уровня титра антител, даже если применялся препарат одной фирмы и по единой схеме иммунизации . Были проведены исследования, в которых попытались максимально приблизить антиген к природному аналогу, добиваясь синтеза в клетках млекопитающих. Однако существенного преимущества перед , продуцируемым в дрожжах, обнаружено не было ii . Длительные наблюдения за массовой вакцинацией в эндемичных районах показали, что применение вакцин на основе позволяет снизить заболеваемость в раз. Например, на Тайване до начата компании по вакцинации новорожденных количество носителей ВГВ достигаю населения . Через лет были обследованы пятнадцатилетние подростки, получившие вакцину при рождении, и молодые люди лег, которые родились раньше и не вошли в число привитых. Среди пятнадцатилетних у 0,7 обнаруживался , в то время как во второй группе таких лиц оказалось 7. Аналогичное исследование, проведенное до начала программы вакцинации, выявило 9,8 носителей . Такой же успех был достигнут в северной Италии Vi . Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков высокая стоимость препарата и необходимость трехкратного введения для достижения длительного протективного ответа. Эти факторы мешают осуществлению масштабных программ профилактики, особенно в развивающихся странах. Следует также отметить, что элиминацию вируса гепатита В нельзя осуществить в короткий срок массовой вакцинации, как это произошло с вирусом натуральной оспы, т. В, лечение которых на сегодняшний день является нерешенной проблемой. Таким образом, в случае гепатита В массовая вакцинация должна охватывать большой временной промежуток, не меньше продолжительности жизни носителей вируса. При массовой вакцинации выявилась еще одна проблема мутации в геноме вируса, позволяющие патогену избежать элиминации из организма вакцинированных. Так, в работе , описано случая заболевания детей в больницах южной Италии после вакцинации. У пациентов были обнаружены маркеры активной репликации вируса. Исследования вирусных геномов показали, что большинство изолятов вируса содержали мутации в районе основной антигенной детерминанты аминокислотные замены или делеции. В дру гом регионе проведения вакцинации в Китае из 6 здоровых иммунизированных взрослых людей через год после вакцинации у шести была обнаружена вирусная ДНК в сыворотке крови. В четырех изолягах вируса были выявлены мутации в главной антигенной детерминанте Не , . Еще одна проблема применения современных вакцин не 0ная эффективность. Этот параметр не так важен для массовых вакцинаций населения, 5 лиц не внесут кардинальных изменений в эпидемиологическую ситуацию. Однако есть группы профессионального риска, в первую очередь медицинские работники, для которых важна гарантия защиты от заболевания гепатитом В. Одно из направлений улучшения вакцины на основе антигена включение в сс состав районов и 2 . Испытания вакцин, включающих в себя не только , но и районы целиком или частично, показали, что такие препараты у вакцинированных индуцируют синтез антител к районам iv . Более того, такие препараты вызывали синтез антител к у пациентов, иммунная система которых раньше не отвечала на стандартную вакцину. Исходя из роли в иммунном ответе районов см.