Тирозин - фенол-лиаза : Структура и функция

• Автор: Демидкина, Татьяна Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 203 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы "Структурные и функциональные
исследования пиридоксаль — Р — зависимых ферментов".
1.1. Катализ с участием пиридоксаль
1.2. Классификация пиридоксаль — Р — зависимых ферментов
1.3. Пространственные структуры пиридоксаль — Р — зависимых ферментов
1.4. Контроль реакционной специфичности пиридоксаль — Р — зависимых ферментов
1.5. Обеспечение субстратной специфичности пиридоксаль — Р — зависимых ферментов
1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков пиридоксаль — Р — зависимых ферментов
1.7. Роль моновалентных катионов в ферментативном катализе
Глава 2. Результаты и обсуждение
2.1. Очистка тирозин — фенол — лиазы и исследование физико — химических параметров фермента
2.1.1. Получение гомогенных препаратов фермента из Citrobacter intermedius и из Erwinia herbicola
2.1.2. Исследование четвертичной структуры фермента
2.1.3. Клонирование и секвенирование гена тирозин — фенол —лиазы из Citrobacter freundii
2.2. Исследование каталитических свойств тирозин — фенол —лиазы
2.2.1. Исследование факторов, определяющих субстратную специфичносить тирозин — фенол—лиазы
2.2.2. Влияние моновалентных катионов на тирозин — фенол—лиазу

2.2.3. Трансаминирование — побочная реакция, катализируемая тирозин — фенол—лиазой
2.3. Кристаллизация и структурные исследования тирозин — фенол —лиазы
2.3.1. Получение кристаллов апофермента и холофермента
2.3.2. Четвертичная структура тирозин — фенол —лиазы
2.3.3. Вторичная, третичная структура и доменное строение субъединиц
2.3.4. Пространственная структура холофермента и локализация центра связывания моновалентного катиона в пространственной структуре холофермента
2.3.5. Кристаллизация и структурные исследования фермент — ингибиторных комплексов тирозин — фенол—лиазы
2.4. Исследование мутантных форм тирозин — фенол —лиазы
2.5, Химический механизм реакции (5 —элиминирования, катализируемой тирозин — фенол —лиазой
Глава 3. Методы исследования
Основные результаты и выводы
Список цитированной литературы

ВВЕДЕНИЕ.
Ферменты, содержащие в качестве кофермента пиридоксаль — 5' — фосфат, катализируют разнообразные реакции метаболизма аминокислот — трансаминирование, Р — элиминирование, 3 — замещение, а,Р
декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Пиридоксаль — 5' — фосфат (пиридоксаль — Р) является уникальным коферментом, поскольку ни один из известных ныне коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций. Субстратную и реакционную специфичность каждого конкретного пиридоксаль — Р — зависимого фермента обеспечивает его белковая часть.
Несмотря на физиологическую важность реакций, катализируемых этими ферментами, и медицинскую и коммерческую ценность продуктов этих реакций, структурные основы механизма действия этих ферментов исследованы до сих пор недостаточно. До 1993 г. пространственные структуры были определены только для ферментов, принадлежащих к классу трансфераз. В 1993 г. были определены пространственные структуры двух пиридоксаль — Р — зависимых ферментов — тирозин — фенол — лиазы и диалкилглициндекарбоксилазы. Позднее были определены трехмерные структуры еще нескольких ферментов.
Определение пространственных структур для разных классов пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и для ферментов одного класса, но использующих различные аминокислоты в качестве субстратов, позволит получить новые важные данные для понимания одной из основных проблем биологии — проблемы взаимосвязи структура — функция ферментов, выяснить пути эволюции пиридоксаль — Р — зависимых ферментов и создать

двумя типами остатков: 1) остатками, которые стабилизируют как
фермент — субстратный комплекс так и переходное состояние реакции и 2) остатками, которые стабилизируют лишь переходное состояние реакции. Остатки второго типа более эффективны, поскольку они повышают величину кса1/Км, не уменьшая значение константы Михаэлиса; при фиксированном значении кса1/Км малое по сравнению с физиологической концентрацией субстрата значение Км менее выгодно для катализа (41). Однако эволюционная "стоимость" этих остатков по сравнению с остатками первого типа должна быть гораздо больше. Если фермент уже имеет механизм, который использует часть энергии взаимодействия с субстратом для понижения энергетического уровня переходного состояния, этот механизм может компенсировать уменьшение величины Км в случае использовании в катализе остатков первого типа и их более низкая по сравнению с остатками типа эволюционная стоимость приводит к их предпочтительному использованию для понижения энергетического уровня переходного состояния ферментативной реакции.
Для большинства пиридоксаль — Р — зависимых ферментов в связывании аминокислот — субстратов участвуют остатки аргинина, которые взаимодействуют с а — карбоксильными группами субстратов: Агд386 в аспартатаминотрансферазе (4), Агд404 в тирозин — фенол —лиазе (6), Агд414 в триптофан — индол —лиазе (22) и Агд406 в диалкилглициндекарбоксилазе (5). Примечательным является практически полное совпадение порядковых номеров для остатков аргинина. Эти ферменты принадлежат к а —семейству; атом азота пиридинового кольца кофермента во всех ферментах взаимодействует с отрицательно заряженной боковой карбоксильной группой остатка аспарагиновой