Структура углеводсвязывающих пептидов лектина бобовых растений в связи с их различной хозяйской специфичностью при образовании симбиоза с клубеньковыми растениями

• Автор: Баймиев, Алексей Ханифович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Введение.

Г лава 1. Обзор литературы.

1.1. Происхождение бобоворизобиалыюго симбиоза

1.2. Специфичность образования бобоворизобнального симбиоза.

1.2.1. Механизмы инфекции и клубенькообразования.

1.2.2. Сигналлинг между ризобией и бобовым растением

1.2.3. Лектины бобовых растений

1.3. Современная систематика клубеньковых бактерий и проблема детекции штаммов ризобий

1.3.1. Особенности организации генома клубеньковых бактерий

1.3.2. Систематика клубеньковых бактерий.

1.3.3. Применение современных методов молекулярной биологии для определения штаммов ризобий
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Краткая характеристика объектов исследований
2.2. Выделение и очистка ДНК растений
2.3. Выделение и очистка ДНК ризобий.
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
2.5. Выделение мегаплазмидной ДНК ризобий
2.6. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК
2.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами
2.8. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.
2.9. Препаративный гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях.
2 Элюция ДНК из агарозных гелей
2 Клонирование фрагментов генов лектина бобовых растений.
2 Перенос ДНК из агарозных гелей на мембранные фильтры блоттинг
2 Радиоактивное мечение препаратов ДНК
2 Блотгибридизация ДНК.
2 Полимеразная цепная реакция.
2 Подготовка компетентных клеток
2 Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной
2 Секвенирование ДНК ферментативным методом.
2 Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях секвенирующий гельэлектрофорез.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.
2 Бактериальные штаммы и фагмидные вектора
2 Реактивы и материалы
2 Составы использованных стандартных растворов
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.
3.1. Сравнение углеводсвязывающих пептидов лектина бобовых растений
3.1.1. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и амплификация участка гена лектина у различных представителей бобовых растений
3.1.2. Клонирование и секвенирование фрагментов гена лектина различных представителей бобовых растений.
3.1.3. Клонирование и секвенирование полноразмерного гена лектина гороха посевного сорта Неосыпающийся1
3.1.4. Сравнительный анализ нуклеотидных последовагельнос
тей секвсннрованных фрагментов генов лектина
3.1.5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей лектинов бобовых растений
3.2. Анализ информативности некоторых современных методов идентификации ризобий на примере . .
3.2.1. Метод геномной дактилоскопии с использованием в качестве гибридизационного зонда ДНК фага М
3.2.2. Метод ЯАРЭ анализа с использованием произвольных праймеров
3.2.3. Метод концевого мечения рестрикционных фрагментов
3.2.4. Сравнение степени пригодности ПДРФ, КАРИ и КМРФ анализов для идентификации штаммов ризобий козлятника
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Впервые показана генетическая удаленность штаммов ii , нодулирующих козлятник восточный, от штаммов, вступающих в симбиоз с козлятником лекарственным. Полученные результаты расширяют представление о строении молекул лектинов бобовых растений и демонстрируют неоднородность их углеводсвязывающих пептидов, а также способствуют более полному пониманию формирования специфичности данных белков к углеводам и принципов образования групп перекрестной инокуляции бобовых растений. Даны практические рекомендации по использованию различных методов идентификации ризобий. Показано, что для паспортизации штаммов ризобий более пригоден высокоэффективный и чувствительный метод концевого мечения рестрикционных фрагментов. Апробация работы. Болгария, на ой международной конференции 1Шег1ес Портсмут, Великобритания, . Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов лектинов из родов бобовых депонированы в международных банках данных ООВДЕМВЬОепВапк. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы глава 1, описания объектов и методов исследования глава 2, результатов исследования и их обсуждения глава 3, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 8 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 1 страницах и содержит рисунков и 3 таблицы. Глава 1. Предполагают, что симбиоз бобовых растений с ризобиями сложился в меловой период и возник первоначально у тропических представителей этого семейства , v, . В то время почвы были бедны азотом, что обусловило отбор в пользу растений, вступающих в симбиоз с азотфиксирующими микроорганизмами. Способность к симбиозу имеет монофнлитичсское происхождение у бобовых растений и полифилитическос происхождение у клубеньковых бакгерий, что является важным доказательством ведущей роли растенияхозяина в становлении симбиоза Проворов, . Бобовые растения составляют группу, рассматриваемую обычно как семейство, реже как порядок цветковых растений и, несомненно, имеющую единое происхождение Яковлев, , тогда как ризобии, способные формировать азотфиксирующие клубеньки на корнях бобовых растений, представлены, по крайней мере, четырьмя отдаленными родами эубактерий ii. По данным Яковлева, к началу х годов было изучено только около видов бобовых. Примерно изученных видов имеют клубеньки. Причем у эволюционно продвинутых мотыльковых iii и мимозовых ii способность к симбиозу обнаружена у обследованных родов и у видов, тогда как у наиболее древних цезальпиниевых iii, являющихся предками мотыльковых и мимозовых, лишь у родов и видов Яковлев, . Проворов, . Видимо предки бобовых имели свойство формировать на корнях клубенькоподобные структуры, в которых могли поселяться дназотрофные бактерии, что явилось своеобразной прсадаптацией, которая позволила бобовым в ходе эволюции развить способность к азотфиксирующему симбиозу , , . Считается что одной из функций таких псевдоклубеньков могло быть накопление и хранение крахмала . Подтверждением данной гипотезы служит обнаружение у люцерны i iv способности формировать в стерильных условиях псевдоклубеньки, близкие по структуре к нормальным клубенькам, возникающим при инокуляции растений штаммами ii ii i . Таким образом, возникновение бобоворизобиального симбиоза началось с разных отправных точек азотфиксация у ризобий, образование клубенькоподобных структур у растений и завершилось формированием v комплементарных адаптивноценных симбиотических признаков способность индуцировать образование клубеньков, заселять эти клубеньки и утилизировать поступающие в них растительные метаболиты у ризобий способность активировать бактериальные iгены и ассимилировать образующийся в результате их работы аммоний у растений и модификацией признаков, имевшихся до начала коэволюции гипериндукция нитрогеназной активности, связанная с развитием особых цитохромных систем и сопровождающаяся репрессией многих метаболических функций и глубокой дифференцировкой у ризобий формирование клубеньков при взаимодействии только с комплементарными штаммами ризобий у растений.