Изотермические и управляемые сменой температур реакции амплификации и высокочувствительной детекции специфичных последовательностей нуклеиновых кислот в реальном времени

• Автор: Чемерис, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 158 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы амплификации и высокочувствительной детекции

специфичных фрагментов ДНК и РНК

1.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени ПЦРРВ

1.3. Лигазная цепная реакция ЛЦР

1.4. Амплификация смещением цепи i iii

1.5. Амплификация но типу катящегося кольца или рамификация

1.6. Технология циклирующей пробы.

1.7. Гибридизационная цепная реакция ГЦР
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объекты исследований.
2.2. Фосфорилирование олигонуклеотидов
2.3. Выделение и очистка нуклеиновых кислот.
2.4. Получение кДНК.
2.5. Полимеразная цепная реакция
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.
2.7. Лигазная ценная реакция в реальном времени с красителем 1
2.8. Лигазная ценная реакция, основанная на эффекте, в режиме реального времени 5
2.9. Проведение амплификации по типу катящегося кольца с дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы в реальном времени.
2 Рамификация в реальном времени.
2 Гибридизационная цепная реакция в реальном времени
2 Электрофоретический анализ ампликонов и исходных молекул нуклеиновых кислот.
2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
2 Использованные в работе обычные и модифицированные олигонуклеотиды
2 Основные реактивы, использованные в работе.
2 Составы использованных стандартных растворов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
3.2. Лигазная цепная реакция в реальном времени
3.3. Амплификация по типу катящегося кольца с
дезоксирибозимным расщеплением химерной пробы
3.4. Рамификация в реальном времени
3.5. Гибридизационная цепная реакция в реальном времени.
3.6. Применимость реакций амплификации и высокочувствительной детекции в реальном времени для фундаментальных исследований и диагностических целей.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


И хотя такая амплификация тоже есть высокочувствительная детекция мы решили ее все же отграничить от реакций, где исходное количество интересующих экспериментатора тех или иных участков ДНК или РНК остается неизменным, но благодаря их присутствию в реакционной смеси происходит фактически накопление или иначе амплификация какоголибо сигнала в наших случаях флуоресцентного, обеспечивающая эту самую высокочувствительную детекцию. В основе всех методов амплификации и высокочувствительной детекции специфичных фрагментов нуклеиновых кислот лежит принцип комплементарности азотистых оснований и возможность образования гибридных молекул, как ДНКРНК, так и ДНКДНК или РНКРНК, где одна цепь выступает мишенью, а другая гибридизационной пробой. Разработка методов молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и способов детекции гибридных молекул стала развиваться в начале х гг. , i, . Чуть более производительным был предложенный тогда же метод агаровых колонок , , , где гибридизацию нуклеиновых кислот уже можно было считать твердофазной. ДНК, сыгравшего очень значительную роль в познании структурной организации геномов различных организмов i, , . Наибольший вклад в то время в развитие метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот был сделан . i и его коллегами. Так, в одной работе ими был разработан метод деления гибридных молекул с помощью хроматографии на метилированном альбумине, сорбированном на кизельгуре i . Однако серьезный прорыв в этой технологии был сделан, когда для сорбции одноценочечной ДНК были применены мембранные фильтры из нитрата целлюлозы ii, i, , после чего последовали другие работы, направленные на улучшение этого метода , , , и др. Новый прогресс в молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот в середине х гг. ДНК с гибридизацией на мембранных фильтрах, на которые ДНК из геля первоначально только агарозного переносилась методом, получившим название блоттинга по Саузерну по фамилии экспериментатора, его разработавшего , . В конце х годов, практически одновременно, четыре исследовательские группы две в Англии, одна в России и еще одна в Югославии предложили различные варианты нового подхода к молекулярной гибридизации, ставившие целью разработать производительное и простое секвенирование ДНК Лысов и др. i, i, . . Серьезной конкуренции этот метод секвенирования другим подходам к этому важному процессу так пока и не составил, однако послужил основой для формирования нового направления ДНКчиповой технологии, которая сейчас очень широко используется, о чем свидетельствует возникновение множества фирм, специализирующихся на изготовлении ДНКчипов. Д1ПСчипами разных производителей, в ее основе лежит тот же принцип комплементарности нуклеотидов, и экспериментаторам предлагается выбрать наиболее подходящий для их задач тип ДНКчипа. Важным моментом в гибридизации нуклеиновых кислот всегда являлось мечение гибридизационных проб. На протяжении первых десятилетий главным типом метки была радиоактивная, и преимущественно использовался радиоактивный фосфор. Для гибридизации i i более подходил тритий. Довольно небольшой период пришелся на использование гибридизационных зондов, меченных I . . В дальнейшем спектр использовавшихся для мечения меток был заметно расширен . Были предложены такие способы, как мечение биотином . , , , разработаны хемилюминесцентные i . , i, и флуоресцентные пробы, в том числе с эффектом . Вышеупомянутые методы молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот характеризовались каждый своей чувствительностью, позволяя с помощью той же блотгибридизации по Саузерну работать с генами, представленными в геноме единичными копиями, но не с представленными в реакционной смеси единичными молекулами ДНК. С появлением метода полимеразной цепной реакции ii . ПЦР. Причем некоторый бум вокруг всего этого пришелся на самый конец х и начало х гг.