Открытая рамка считывания ybhE Escherichia coli кодирует ранее неизвестную 6-фосфоглюконолактоназу (Pgl)

• Автор: Зименков, Данила Вадимович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работы.

Научная новизна и практическая значимость.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I .Окислительная ветвь пентозофосфатного пути.

Роль пентозофосфатного пути в центральном метаболизме. IО

Г люкозо6фосфат дегидрогеназа .

6фосфоглюконолактоназа 6 6фосфоппоконат дегидрогеназа , 6.

Источники в клетке.

Распределение метаболических потоков в .i. Роль окислительной ветви пентозофосфатного пути.
Окислительный стресс.
II. Современные методы модификации хромосомы. Неспецифическая зависимая интеграция.
Сайтспецифическая рекомбинация. Гомологичная рекомбинация в Е.i.
Модификация хромосомы линейными ДНК.
Методы получения точечных мутаций.
Селективные маркеры.
Краткое заключение. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды.
2. Генноинженерные методики.
3. Р1зависимая трансдукция.
4. Модификация хромосомы с использованием системы рекомбинации бактериофага X.
5. Удаление маркера устойчивости из хромосомы.
6. тест.
7. Определение активности 6фосфоглюконолактоназы.
8. Экспрессия и очистка белка i6.
9. Интеграция экспрессионной кассеты.
. Определение точек интеграции.
. Штаммыпродуценты аминокислот, культивирование.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Идентификация структурной части гена .i.
1.1. Штамм проявляет свойства мутанта.
1.2. ген из .i комплементирует фенотип штамма.
1.3. Очистка белка с i и определение его 6 активности.
1.4. Поиск белков гомологичных в других организмах.
2. Увеличенная экспрессия приводит к увеличению продуктивности штаммовпродуцентов ароматических аминокислот.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Наш интерес к окислительной ветви РРР также был обусловлен значимостью увеличения синтеза метаболических предшественников при создании промышленных штамммовнродуцентов ароматических аминокислот. В отличие от большинства аминокислот, предшественниками которых являются метаболиты гликолиза и цикла трикарбоновых кислот, в синтез ароматических аминокислот структурно вовлечены соединения, образующиеся в РРР. Обычной стратегией усиления потока через какуюлибо ветвь метаболизма, является увеличение экспрессии всех генов, кодирующих ферменты данного пути. Однако то, что гену не сопоставлена открытая рамка считывания, делает реализацию данной стратегии невозможной. Следует отметить, что в большинстве стран действует ограничения i на промышленные штаммыпродуценты. При этом ограничении никакой гстсрологичной информации не должно содержаться в штамме, и, поэтому, ввести чужеродный ген и оптимизировать его экспрессию не представляется возможным. В связи с этим, актуальным представлялась идентификация . Цель и задачи работы. Диссертационная работа посвящена идентификации структурной части гена, кодирующего 6 . . Научная новизна и практическая значимость. В ходе работы на хромосоме . , было основано как на фенотипическом анализе делеционного мутанта и комплементации мутантного фенотипа введением охарактеризованной 6фосфоглюконолактоназы из другого организма, так и очисткой соответствующего белкового продукта и определением его активности i vi. Обнаружение гомологичных белков в других организмах позволяет утверждать, что охарактеризованный фермент является первым членом нового семейства 6фосфоглюконолактоназ. Были созданы хромосомные модификации, связанные с введением перед идентифицированной рамкой считывания гаоподобных промоторов, приводящие к усилению транскрипции и увеличению активности 6фосфоглюконолактоназы в клетках модифицированных штаммов . Данные модификации при введении в модельные штаммыпродуценты фенилаланина и триптофана приводили к значимому увеличению накопления целевых аминокислот. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В настоящее время изучение биологии микроорганизмов расширяется от изучения отдельных генов и регуляторных путей к изучению клетки в целом, как единого механизма. Следует отметить, что хотя к такому изучению и стремились всегда, тем не менее только разработка и развитие новых методов изучения, таких как транскриптомика, метаболомика, анализ метаболических потоков и др. В свою очередь, такой взгляд на клетку даст материал для детальной разработки механизмов функционирования и биохимии регуляторных систем метаболизма. В процессе создания штаммовпро дуцентов биологическиактивных веществ, исследователи сталкиваются с рядом сложных задач по скоординированному изменению уровней экспрессии ансамблей генов, усиливающих определенные метаболические потоки. При этом необходимо знать и учитывать глобальные изменения в метаболических и регуляторных процессах вызванных такими изменениями. Однако для целей усиления метаболического потока через данную ветку мало знать все гены, кодирующие ферменты этого пути, и их регуляцию, важно также представлять каким будет адаптивный ответ клетки на усиление того или иного метаболического потока. Соответственно, первая часть Обзора Литературы посвящена генетике, регуляции экспрессии генов и метаболическим потокам в окислительной ветви пентозофосфатного пути с точки зрения роли данного пути в центральном метаболизме бактериальной клетки. Также рассматриваются изменения, индуцированные делениями ряда генов центрального метаболизма, связанные с изменением потоков через пентозофосфатный путь. С другой стороны, в ходе выполнения экспериментальной части диссертационной работы использовался широкий набор методов геномной инженерии, таких как немаркированные делеции генов, интеграция экспрессионных кассет в хромосому, направленное изменение уровня экспрессии генов. Поэтому во второй части Обзора рассматриваются современные методы направленной и контролируемой модификации хромосомы .