Характеристика нового гена cry 28Аа и изучение факторов, определяющих локализацию дельта-эндотоксинов в спорулирующих клетках Bacillus thuringiensis ssp. finitimus

• Автор: Войцеховская, Яна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Факторы, определяющие энтомопатогенность В. iii

I. Структура и классификация дельтаэндотоксинов

1. Общая структура дельтаэндотоксинов

2. Классификация дельта эндотоксинов.

3. Доменная структура, механизм действия дельтаэндотоксинов и эволюция доменной структуры.

II. Особенности В.iii как энтомоцидного микроорганизма и его экологическая ниша

1. Действующие энтомоцидные агенты В.iii.

2. белки, синтезируемые другими энтсмопатогеиными бактериями. Экологическая ниша В. iii

III. Организация генома В. iii.

1. Организация генома В. iii.
2. Положение генов в геноме В.iii
IV. Регуляция синтеза, дельта эндотоксинов
1. Промоторы.
2. Колийность плазмид, зключающих гены.
3. Стабильность мРНК.
V. Споруляция В. iii.
1. Общая морфология слоруляции у бацилл
2.Особенности слоруляции В.iii.
Экзоспориум
VI. Характеристика В. iii . iii и его особенности
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
I. Клонирование и характеристика гена нового дельтаэндотоксина сгуАа из В. игпдепяз яэр. 5л Епшз. .
1. Конструирование геномного банка и клонирование гена сгуАа.
2. Анализ последовательности клонированного фрагмента
и структура геномного локуса гена сгуАа
II. Исследование функциональности генов сгуАа и сгуАа,
клонированных из В. iii .
ii i
1. Анализ продуктов экспрессии генов дельтаэндотоксинов и сгуАа з клетках акристаллического штамма В. iii . i.
2. Изучение функциональности предполагаемой
промоторной последовательности сгуАа.7
III. Анализ исходного штамма В. iii . iii.7
1. Доказательство существования двух морфологических форм СЦ СВ исходного штамма В. игглдаелзд вБр. iii, способных к образованию соответственно только сцепленных или только свободных кристаллических включений
2. Анализ геномоз дзух морфологических ферм СВ и
СЦ В. iii ББр. iii на наличие генов
сгу2бАа и сгуАа.7
IV. Изучение локализации кристаллических включений при экспресссии реперного гена сгуВАа в клетках двух
морфологических форм СВ и СЦ8
ВЫВОДЫ8
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Во время споруляции из дельта эндотоксинов формируются ейдимые в световой микроскоп кристаллические включения, расположенные обычно рядом со спорой внутри материнской клетки. После лизиса материнской клетки смесь кристаллических включений и спор высвобождается во внешнюю среду. В настоящее время клонировано и секвенировано большое количество сгугеноБ, в результате чего появилась реальная возможность создавать штаммы В. Для создания таких штаммоз необходимо обеспечивать эффективную продукцию рекомбинантных белков в спорулирующих клетках В. Это важная практическая задача, вызывающая повышенный интерес исследователей к проблемам регуляции синтеза дельта эндотоксинов В. Несмотря на интенсивное изучение регуляции транскрипции дельта эндотоксинов, механизм формирования кристалла все еще не ясен. В ряде работ vi, , , показано, что в самом начале своего образования кристалл связан с мембраной экзоспориума, хотя впоследствии утрачивает эту связь и свободно располагается в цитоплазме материнской клетки. Эти и некоторые другие данные позволяют предположить существование структуры, выполняющей роль инициатора образования кристаллов эндотоксинов. У большинства представителей вида В. Тем не менее, существуют подвиды В. Кристаллы, сформированные с внутренней стороны экзоспориума, после лизиса материнской клетки остаются связанными со спорой, в то время как кристаллы с обычным местом закладки остаются свободными. Такой способ закладки кристаллов встречается у 3. В.iii . , . Подвид iii уже привлекал к себе внимание исследователей. В работе указывалось на связь локализации кристаллов внутри экзоспориума с наличием МДа плазмиды. Б этой же работе сообщалось о том, что эндотоксины, образующие свободные и связанные кристаллы, обладают уникальными антигенными свойствами, отличаясь при этом друг от друга. Для другого штамма подвида iii также показана иммунологическая уникальность дельтаэндотоксинов Ревина, , но в отличие от работы , белковый состав свободных и связанных кристаллов оказался сходным. Целью настоящей работы было клонирование и секвенирование одного из генов дельтаэндотоксинов из В. белка, положение гена дельтаэндотоксина в геноме и время начала его экспрессии, на локализацию синтезирующихся белковых кристаллов в спорулирующих клетках В. I. Структура и классификация дельтаэндотоксинов. Общая структура дельтаэндотоксинов. белки или дельтаэндотоксины семейство родственных белков, синтезируемых, как правило, в клетках i iii во время спорообразования. белков различен. Обычно все известные дельтаэндотоксины в слсрулирующих клетках В. В состав кристаллических зключений входят предшественники активных белкоз протоксины. Да. Да или 2 с молекулярной массой 00 кДа. Во втором случае Сконцевая половина молекулы не существенна для токсического действия и полностью гидролизуется ферментами кишечного сока насекомых при формировании истинного токсина, а концевая половина соответствует кДа варианту протоксина , . Предполагается, что С концевая половина 0 кДа белков необходима для правильного формирования кристаллов. Да протоксинсв необходимы шаперонподобные белки i, . Консервативные положения аминокислотных остатков распределены в белках неразномерно, формируя вариабельные и консервативные участки. , рис. Классификация дельта эндотоксинов. белксз , . По типу специфичности белки разбивались на четыре класса класс включал токсины, специфичные только для отряда i, i и i, IГ только для , IV только для i. белков. Ко с увеличением числа известных дельта эндотоксинов стало ясно, что близкородственные по первичной структуре белки могут иметь сильно отличающиеся спектры насекомыхмишеней, а некоторые новые токсины не укладываются в существующую систему классификации , , , . В результате, старая классификация была пересмотрена и предложена новая система, построенная на анализе аминокислотных последовательностей белков.