Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген фибера вируса ССЯ-76 и изучение иммунного ответа лабораторных животных на введение этих плазмид : Генетическая иммунизация

• Автор: Уласов, Илья Валентинович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Принятые сокращения

ВВЕДЕНИЕб

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Аденовирусная инфекция кур

1. 1. Общая характеристика Синдрома снижения

яйценоскости кур 7 6

1. 2. Классификация аденовирусов птиц.

1. 3. Характеристика белкового состава капсида

1. 4. Антигенная активность вирусных белков

2 . ДНКзакцины

2. 1. Общая характеристика ДНКпрепаратов.
2. 2. Механизм индукции иммунного ответа
2. 3. Развитие гуморального иммунного ответа при
генетической иммунизации.
2. 4. Влияние различных факторов на развитие иммунного ответа у генетически иммунизированных
животных.
Глава II. Материалы и методы
1. МАТЕРИАЛЫ 4
1. 1. Вирусы и бактериальные штаммы.
1. 2. Клеточные линии 4
1. 3. Плазмидные векторы 4
1. 4. Иммунные и нормальные сыворотки 4
I. 5. Животные и эмбрионы 4
1. 6. Ферменты и другие реактивы.
2. МЕТОДЫ 4
2. 1. Заражение утиных эмбрионов 4
2. 2. Очистка и концентрирование вируса 4
2. 3. Полимеразноцепная реакция 4
2. 4. Направленный мутагенез 4
2. 5. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2. 6. Выделение аналитических количеств плазмидной
2. 7. Очистка полиэтиленгликолемПЭГ
2. 8. Гидролиз ДНК специфическими рестриктируюшими
эндонуклеазами
2. 9. Фракционирование фрагментов ДНК методом
электрофореза в агарозном геле
2. . Препаративное разделение фрагментов ДНК и
элюция их из геля.
2. . Дефосфорилирование5концов ДНК векторных
плазмид
2. 2. . Лигирование фрагментов ДНК.
2. . Трансформация клеток . i.
2. . Синтез дезоксиолигонуклеотидов.
2. . Реакция сиквенирования.
2. . 1. Радиомаркированиекинированиепраймера
2. . 2. Синтез меченых цепей методом ПЦР.
2. . 3. Электрофорез.
2. . Трансфекция линий клеток эукариот
2. . Электрофорез белков в ПААГДСН.
2. . Окраска белковых полос Кумасси.
2. . Иммуноблоттинг .
2. . Приготовление первичной культуры клеток
эпителия почки 2х дневного цыпленка. 5
2. . Титрование вирусов
2. . Нейтрализация сывороток мышей стандартной
дозой вируса
2. . Иммунизация лабораторных животных.
2. . Реакция бласттрансформации лимфоцитов
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
1. Получение рекомбинатных плазмид, содержащих ген фибера вируса ССЯ, в составе вектора .
1. 1. Анализ вторичной структуры белка фибера вируса
ССЯ7 6, содержащего аминокислотные замены.
1. 2. Получение рекомбинантных плазмид, несущих ген фибера под контролем эукариотического промотора для экспрессии в клетках млекопитающих
1. 3. Получение рекомбинатного бакуловируса, содержащего ген фибера вируса ССЯ7 6.
2. Изучение экспрессии гена фибера i vi
2. 1. Экспрессия белка фибера в составе рекомбинатного бакуловируса
2. 2. Получение антисывороток к мономерной и гримерной фермам белка фибера вируса ССЯ
2. 3. Экспрессия гена фибера в составе рекомбинатных плазмид в культуре клеток млекопитающих.
3. Генетическая иммунизация мышей рекомбинантными плазмидами, содержащими ген фибера вируса ССЯ.
3. 1. Определение оптимальной инъекционной дозы
3. 2. Исследование влияния различных векторов на
уровень гуморального ответа
3. 3. Исследование динамики развития иммунного ответа в организме животного при однократной и
двухкратной инъекциях плазмидой V
3. 4. Детекция уровня вируснейтрализукхцих антител в
сыворотках животных
3. 5. Характеристика клеточного иммунного ответа на
введение ДНКконструкций
Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


По мере разработки и внедрения эффективных биопрепаратов против острых инфекций птиц особое значение приобретает создание средств, блокирующих развитие латентных инфекций, протекающих без ярко выраженных клинических признаков. К этой группе инфекций относится и синдром снижения яйценоскости кур ССЯвпервые описанный v в . Позже вспышки данной болезни регистрировались во многих странах мира с развитым птицеводством США, Франции, Голландии, России и др 5, , , , 0. Для активной профилактики синдрома снижения яйценоскости кур выпускается большое количество монои ассоциированных биопрепаратов, содержащих в своем составе преимущественно инактивированный возбудитель этой болезни . Однако многолетний опыт широкого применения этих и других инактивированных биопрепаратов, с одной стороны, позволяет снизить заболеваемость птицы ССЯ, но с другой стороны, вакцинация не способна ограничить персистенцию вируса. В печати отмечены случаи при которых применение данного типа препаратов не являлось эффективным вследствие снижения своей активности при хранении . В последние годы для целого ряда инфекционных болезней домашних животных таких как ящур, чума плотоядных с использованием генноинженерной технологии были разработаны эффективные биопрепаратыДНКвакцины, превосходящие по эффективности и безвредности своих предшественников . Учитывая структурнофункциональную карту генома вируса ССЯ, опубликованную в печати, а так же имеющийся опыт изучения биохимических и физикохимических свойств белков капсида различных аденовирусов млекопитающих и птиц представляется актуальным разработка схем получения ДНКвакцин против синдрома снижения яйценоскости кур7 б . Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание банка рекомбинантных плазмид, содержащих ген фибера вируса ССЯ под контролем различных промоторов, и последующее изучение иммунного ответа лабораторных животных после введения им генноинженерных конструкций, а также анализ антигенных свойств белка фибера, синтезированного i vi, под контролем различных промоторов. Создать генноинженерные конструкции, содержавшие как нативный ген фибера, так и его мутантные формы, с заменами в вариабельной части гена, под контролем эукариотических промоторов. Получить рекомбинатный бакуловирус, несущий ген фибера вируса ССЯ. Исследовать физикохимические и антигенные свойства экспрессируемого белка. Научная новизна и практическая значимость. Впервые был амплифицирован и клонирован ген фибера вируса синдрома снижения яйценоскости кур ССЯ. Показана возможность экспрессии полученных конструкций i vi. Ген фибера вируса ССЯ был экспрессирован в составе бакуловирусного вектора. На экспрессируемый продукт рекомбинатный белок была получена сыворотка специфичная к мономерной форме белка фибера. Исследовано влияние замен в составе гена фибера ка конформациокные и иммуногенные свойства рекомбинатного белка. Получены данные о динамике развития иммунного ответа на введение рекомбинатных ДНК, которые представляют не только научный, но и практический интерес. Показано, что инъекция полученными конструкциями, вызывает образование гуморальных вируснейтрализующих антител. Обзор литературы. Аденовирусная инфекция кур. Общая характеристика ССЯ. ССЯ представляет собой вирусное заболевание, поражающее кур несушек мясных и мясояичных пород. Зпервые данная болезнь была описана голландскими учеными во главе . . V в 7 6 году. В том же 7 6том году дром . В. был выделен вирус из слизистой оболочки носовой полости и гортани кур . Изолированный ими штамм вируса ССЯ в настоящее время известен как штамм 7. Значительнее позднее в x выделил вирус, идентичный по серологическим свойствам штамму 7 в последствии этот штамм получил название ВС . В настоящее время известен целый ряд штаммов вируса ССЯ , серологически идентичных изоляту 7. Так, в Великобритании был выделен ВС, в Венгрии В8, в Италии Е, во Франции , в Японии 1 . Долгое время считалось, что вирус поражает уток и кур. Однако, суммируя результаты, полученные .