Влияние регуляторных генов ВИЧ-1 tat и nef на пролиферацию, морфологию и дифференцировку клеток грызунов in vitro

• Автор: Шугурова, Ирина Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫИ

1.1. Вирус иммунодефицита человека

1.2. Геном ВИЧ

1.3. Эффекты гена 2

1.4. Эффекты гена пе

1.4.1. Генные мишени в Тклетках

1.5. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессах

дифференцировки и развития

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Культуры клеток
2.1.1. Псевдонормальная линия клеток фибробластов крысы 2
2.1.2. Первичные фибробласты крысы
2.1.3. Глиальные клетки
2.1.4. Клетки феохромоцитомы крысы
2.1.5. Первичные эмбриональные фибробласты мыши
2.1.6. Эмбриональные стволовые клетки
2.2. Плазмиды, использованные в экспериментах
2.3. Перенос генов в клетки методом электропорации
2.4. Получение поликлональных и трансфицированных культур
2.5. Тестирование переноса генов
2.6. Изучение пролиферации клеток
2.7.Изучение дифференцировки клеток
2.8. Цитохимический тест для выявления активности щелочной фосфатазы
2.9. Иммуноцитохимический анализ
2 Статистическая обработка результатов экспериментов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Конструирование и анализ рекомбинантных плазмид с экспрессирующимися генами ВИЧ1
3.1.2. рМТ
3.1.3.
3.1.4. и
3.2. Эффекты гена ВИЧ1
3.2.1. Морфология и пролиферативная активность трансфицированных псевдонормальных фибробластов крысы линия 2
3.2.2. Онкогснный потенциал гена и кооперативный эффект
3.2.3. Морфология и пролиферативная активность клеток фсохромоцитомы крысы линия , трансфицированных геном
3.2.3. Нейрональная дифференцировка и пролиферативная активность трансфицированных клеток феохромоцитомы крысы в присутствии фактора роста нервов
3.3. Эффекты гена яеВИЧЛ
3.3.1. Морфология летрансфицированных первичных фибробластов эмбрионов крысы
3.3.2. Морфология и пролиферативная активность клеток фсохромоцитомы крысы линия , трансфицированных геном
3.4. Влияние генов и на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши
3.4.1. Оценка активности промотора V
3.4.2. Пролиферативная активность генетически модифицированных линий ЭС клеток
3.4.3. Дифференцировка трансфицированных ЭС клеток
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Особое внимание было уделено влиянию вирусов иммунодефицита и их отдельных генов на клеточный метаболизм и зависимость репликации вирусов от многих факторов клетокхозяев Свердлов, Тарантул, . В первых же экспериментах было показано, что в ряде патологических процессов, сопровождающих ВИЧинфекцию, могут участвовать продукты как структурных, так и регуляторных генов ВИЧВИО. Глубокое и всестороннее изучение функций вирусных генов, которое можно назвать этапом функциональной анатомии генома вируса, позволит получить информацию для следующего этапа синтеза исследования функций целого вирусного генома в координированном взаимодействии его отдельных генов между собой и с геномом клеткихозяина. Большое внимание в этих исследованиях было обращено на изучение роли регуляторных генов ВИЧВИО, которые участвуют не только в регуляции экспрессии и репликации вирусного генома, но также оказывают существенное влияние на метаболизм клеток. Это делает возможным поиск более эффективных медикаментозных способов борьбы с клиническими проявлениями ВИЧинфекции. Объектами наших исследований являлись два регуляторных гена ВИЧ и . Эти гены, по существовавшим к началу настоящей работы данным, имели разнонаправленное влияние на экспрессию и репликацию ВИЧ в клетках. Ген рассматривался как трансактиватор транскрипции ВИЧ, а ген как негативный фактор экспрессии вирусных генов и репликации вируса. Однако уже первые исследования по влиянию продуктов регуляторных генов на клеточный метаболизм показали, что существует тесная взаимосвязь между этими процессами. Постепенно накапливались данные, указывающие на плейотропные эффекты генов и на клетки, и их участие в развитии некоторых патологий, сопутствующих СПИДу. Продукт гена представляет собой секретируемый фактор, который является трансактиватором транскрипции как вирусных, так и отдельных клеточных генов, влияет на рост и пролиферацию клеток, их миграцию, апоптоз и ангиогенез. Наряду с этим ген иногда оказывает и ингибирующее воздействие на экспрессию клеточных генов. Показана нейротоксичность белка , которая проясняет молекулярные механизмы некоторых нейропатологий, сопровождающих СПИД. Важным было обнаружение у гена онкогенного потенциала, который, повидимому, ассоциирован с развитием лимфом и саркомы Капоши у ВИЧинфицированных пациентов. В дальнейшем было определено, что многие из эффектов гена на клетки осуществляются в результате взаимодействия белка с определенным набором клеточных белков. Ген участвует в многочисленных процессах, происходящих в клетках, в частности в негативной и в позитивной регуляции экспрессии клеточных генов, а также в репликации вируса. Кроме того был обнаружен эффект гена на эндоцитоз и ряд других процессов. На астроцитах человека был выявлен модулирующий эффект гена на уровень , что проявлялось в задержке апоптоза ii, . В настоящее время ясно, что продукт гена также как и гена , взаимодействует в клетках с большим числом белков, участвующих в передаче клеточных сигналов и транспорте белковых продуктов i . . Таким образом, имеющиеся данные указывают на полифункциональность генов и ВИЧ1 на клетки. Однако в полной мере молекулярные механизмы влияния продуктов этих генов на процессы метаболизма в клетках и их роль в развитии различных патологий у ВИЧинфицированных пациентов остается неизвестной. Остается также много вопросов, связанных с видоспецифическими эффектами продуктов этих двух регуляторных вирусных генов. Нами проведены эксперименты по изучению влияния регуляторных генов ВИЧ на непермиссивные к вирусу нормальные, псевдонормальные и злокачественные клетки грызунов. Это позволило изучить общие эффекты воздействия на клетки, присущие отдельным продуктам вирусных генов, что в дальнейшем может быть использовано в разработке эффективных подходов к терапии ВИЧинфицированных больных, созданию принципиально новых высокоспецифичных медицинских препаратов.