Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад

• Автор: Измалкова, Татьяна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ

АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ

1.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ПАУ

1.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ПАУ БАКТЕРИЯМИ

1.3.1. Биохимические пути биодеградации нафталина

1.3.2. Биохимические пути деградации фенантрена

1.4. РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ

СИСТЕМ ДЕГРАДАЦИИ ПАУ
1.4.1. Гены катаболизма ПАУ грам отрицательных бактерий
1.4.1.1. Организация генов катаболизма нафталина плазмиды 7.
1.4.1.2. Регуляция генов катаболизма нафталина плазмиды 7.
1.4.1.3. Генетические системы катаболизма нафталина
аналогичные япьгенам плазмиды 7
1.4.1.4. Генетические системы катаболизма нафталина,
отличающиеся от архетипа плазмиды 7
а гены i.
б гены i . штамм 2.
в гены i . 7.
г гены катаболизма ПАУ бактерий рода i.
д гены i . А5
1.4.2. Гены катаболизма ПАУ грам положительных бактерий
1.4.2.1. тзггены бактерий рода
1.4.2.2. Организация генов катаболизма фенантрена ii . КР7.
1.5. УЧАСТИЕ ПЛАЗМИД В БИОДЕГРАДАЦИИ ПАУ.
1.6. ПУТИ ЭВОЛЮЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМ
КАТАБОЛИЗМА ПАУ
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Питательные среды и условия роста
2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов
2.4 Выделение тотальной ДНКбактерий.
2.5. Выделение плазмидной ДНК.
2.6. Конъюгационный перенос плазмид.
2.7. Полимеразная цепная реакция
2.8. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
2.9. Электрофорез в агарозном геле
2 Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.
2. Мечение ДНК методом рассеянной затравки
2. Гибридизация ДНК на нейлоновых фильтрах
2 Лигирование ДНК.
2 Приготовление компетентных клеток Е.со
2. Трансформация клеток Е.со плазмидной ДНК.
2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2. Определение удельных активностей ферментов.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Изоляция и характеристика штаммов деструкторов нафталина
3.2. Генотипический анализ штаммов Р. АиогеБсепз
3.3. Участие плазмид в генетическом контроле деградации
нафталина и фенантрена
3.4. Анализ удельных активностей ферментов биодеградации
нафталина, фенантрена и салицилата
3.5. Амплификация и ГЬР анализ
ключевых генов био деградации нафгалина.
3.6.Анализ генов паИАс штаммовдеструкторов нафталина.
3.7. Анализ генов паЮ штаммовдеструкторов
3.8. Салицилат 5гидроксилаза в штамме Р. риса АК5.
3.9. Амплификация регуляторного гена паИЯ.
3 Амплификация генов орто и мета пути деградации катехола
3 Анализ штаммов на наличие
плазмид биодеградации нафталина 1псР9 группы
3 Геномный фингерпринт
штаммовдеструкторов нафталина, содержащих Р9 плазмиды
3 анализ плазмид р и 6 подгрупп Р9 группы несовместимости
3 Анализ штаммов деструкторов нафталина
на наличие плазмид 1псР7 группы.
3 Локализация генов биодеградации нафталина
в штаммах хозяевах 1псР7 плазмид
3 анализ 1псР7 плазмид.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Транспозонная организация катаболических оперонов, а также высокая гомология генов биодефадации подразумевают возможность их независимой эволюции путем транспозиционных и рекомбинационных событий, что наряду с горизонтальным генетическим переносом является мощным фактором распространения таких оперонов как внутри, так и между микробными популяциями. Изучение разнообразия генетических систем дефадации ПАУ способствует пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе существующих в настоящее время катаболических путей. Российской Федерации, Украины и Беларуси и способных к утилизации нафталина и ею производных. Выделение, определение спектра утилизируемых субстратов и генотипический анализ деструкторов нафталина рода . Изучение роли плазмид в генетическом контроле деградации ПАУ. Определение биохимических путей деградации нафталина, фенантрена и салицилата штаммамидеструкторами. Анализ полиморфизма ключевых генов биодеградации нафталина. Изучение плазмид катаболизма нафталина, принадлежащих к группам несовместимости Р7 и Р9. В настоящей работе проведен анализ генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад, изолированных из различных регионов России, Украины и Беларуси. Установление филогенетической взаимосвязи между штаммами одного вида показало, что многие изолированные из различных географически удаленных регионов Российской Федерации деструкторы ПАУ являются близкородственными. Выделена новая группа генов . Разработаны новые специфические праймеры для обнаружения методом ПЦР и характеристики генов и . Впервые изучено разнообразие генов , обнаружены два новых варианта последовательностей гена . Показано, что встречаемость различных вариантов генов и отличается для штаммовдеструкторов, принадлежащих к разным видам. Обнаружено существование вариации в организации биодеградативных оперонов, включая наличие различных сочетаний генов и в одном и том же штамме, а также присутствие негомологичных генов или . Впервые обнаружено сочетание генов салицилат 5гидроксилазы с классическими генами. Изучены штаммы, имеющие ген салицилат гидроксилазы в трансположении по отношению к ш7оперону. Обнаружено влияние характера синтеза нафталин диоксигеназы на способность микроорганизмовдеструкторов нафталина утилизировать более высокомолекулярные ПАУ фенантрен. Проведен анализ плазмид утилизации нафталина и салицилата ii несовместимости Р7 и Р9. Показано, что плазмиды биодеградации нафталина Р9 группы несовместимости чаще встречаются в штаммах i, в то время как для плазмид группы несовместимости Р7, повидимому, основным хозяином является . Исследованные плазмиды деградации нафталина 9 группы по структурной организации подразделяются на три подгруппы А, В и С. Наблюдается некоторая корреляция между строением репликона 1псР9р и 1псР подгруппы и структурой плазмиды в целом. Плазмиды 1псР7 отличаются большим структурным разнообразием и не образуют какиелибо группы. Анализ генетических систем катаболизма ПАУ представляет несомненный интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Изучение организации генетических систем катаболизма ПАУ является основой понимания эволюционных процессов, приводящих к возникновению разнообразия генов катаболических путей и изменению спектра утилизируемых субстратов, вследствие горизонтального переноса генов, транспозиционных событий, перестановок в ДНК, слияния генов, точечных мутаций и т. Полученная в настоящей работе информация позволяет расширить наши представления об молекулярных механизмах адаптации микроорганизмов к загрязнению окружающей среды ксенобиотиками, а также является предпосылкой для дальнейших исследований. С прикладной точки зрения, разработанные в настоящей работе специфические праймеры могут быть использованы для обнаружения и характеристики штаммовдеструкторов, а также для мониторинга популяций бактериальных деструкторов в загрязненной почве.