Свойства эндонуклеазы SegB бактериофага Т4 и ее роль в генетическом обмене между Т-четными бактериофагами

• Автор: Брок-Волчанская, Вера Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 162 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классы сайтспецифических дезоксирибонуклеаз

1.2. Хомингэндонуклеазы как особый класс ферментов

1.3. ОРС хомйнгэндонуклеаз являются мобильными генетическими элементами

1.4. Хомингэндонуклеазы фага Т4.

1.4.1. Семейство бактериофагов Т4типа на примере бактериофага Т

1.4.1.1. Классификация фагов Т4типа. Исключение фагом Т4 близкородственных фагов.

1.4.1.2. Особенности структуры ДНК бактериофага Т

1.4.1.3. Особенности развития бактериофага Т4.
1.4.2. Кодируемые нитронами хомингэндонуклеазы фага Т
1.4.3. Хомингэндонуклеазы фага Т4 внеинтронной локализации
1.4.4. Транскрипция кластера генов тРНК бактериофага Т
1.4.5. Регуляция экспрессии генов хомингэндонуклеаз фага Т4.
1.5. Практическое применение хомингэндонуклеаз
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы.
2.1.1. Штаммы бактерий и бактериофаги
, 2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды
2.1.3. Праймеры
2.1.4. Среды, основные буферы и растворы.
2.1.5. Материалы и реактивы
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Получение нлазмидной ДНК и определение ее концентрации
2.2.2. Получение геномной ДНК
i 2.2.3. Получение компетентных клеток Е. i и трансформация.
2.2.4. Получение элекгрокомпетентных клеток и электропорация
i 2.2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.2.6. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК
2.2.7. Конструирование плазмид и секвенирование ДНК
2.2.8. Анализ рекомбинантных клонов
2.2.9. Электрофоретическое разделение ДНК
2.2 Электрофорез белков в ПААГ
2.2 Экспрессия ОРС
2.2 Очистка эндонуклеазы и определение концентрации белка.
2.2 Определение эндонуклсазной активности i vi
2.2 Определение точек расщепления и границ сайта узнавания
2.2 Конструирование бактериофага ВДеВ
2.2. . Получение Тчетных бактериофагов и титрование
2.2 Очистка Тчетных бактериофагов равновесным ультрацентрифугированием
в градиенте I
2.2 Скрещивание бактериофагов и анализ потомства.
2.2 ДНКДНК гибридизация гибридизация по Саузерну
2.2 Программное обеспечение
2.2 Конъюгативный перенос плазмид
2.2 Введение ОРС и в хромосому штамма . i и в хромосому штамма 8 .
2.2 Экспрессия генов и в клетках штаммов РАО и РАО
. i.
2.2 Внесение делений в хромосому штаммов и . i.
2.2 Измерение частоты возникновения спонтанных мутаций в штаммах РА и . i.
2.2 Фенотипический анализ штамма 8 . и полученных на его основе мутантов.
2 Приготовление культуры и ее тестирование.
2 Проведение морфологического сравнения колоний
2 Анализ способности клеток использовать в качестве источников углерода различные соединения
2 Измерение кинетических параметров роста
2 Анализ способности продуцировать сидерофоры и экзонротеазу
2 Анализ способности продуцировать 2,4диацетилфлороглюцинол
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .
3.1. оиск сайта гидролиза для эндонуклеазы в популяции Тчетных бактериофагов
3.2. Определение структуры кластера генов тРНК фагов I, 3 и
3.3. Ген кодирует сайтспецифическую эндонуклеазу.
3.4. Биохимические особенности эндонуклеазы
3.5. Предпочтительный сайт расщепления находится в последовательности гена тРНК Тчетных фагов.
3.6. Определение точек гидролиза и границ сайта узнавания в области гена тРНКАэт фага 2.
3.7. Определение точек расщепления эндонуклеазой в последовательностях отдельных генов тРНК фага 2 и реконструирование сайтов узнавания
3.8. Анализ специфичности на гликозилированной ДНК фагов Т4 и
3.9. Эндонуклеаза инициирует нерсципрокный генетический обмен между бактериофагами Т4 и Т
3 Изучение возможности использования для направленного введения мутаций в геном бактерии рода
. Специфичность при гидролизе геномной ДНК бактерий . i и . i.
. Разработка системы направленного мутагенеза с использованием хомингэндонуклеазы или и тестирование ее в штамме
. i.
. Внесение делеции в геном . i штаммов РАО и .7i за счет внутрихромосомной рекомбинации, инициируемой эндонуклеазами или .
3 Тестирование системы индуцированного направленного мутагенеза с использованием эндонуклеазы в штамме 8 . .
ЗАКЛЮЧЕНИИ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Установлено, что ген фага Т4 является мобильным эндонуклеазным геном, который обеспечивает генетический обмен между фагами Т4 и 2 в процессе генной конверсии. Предложен способ регуляции экспрессии гена на уровне трансляции, которая объясняет механизм защиты фага Т4 от кодируемых им эндонуклеаз с вырожденным сайтом узнавания. Научнонрактичсскос значение работы. Данные о сайте узнавания и о двухдоменной организации могут быть полезны при создании новых эндонуклеаз с заданной специфичностью. ДНК, например, с целыо их последующего клонирования. Разработана эффективная система индуцирусмого направленного мутагенеза i viv в бактериях рода , которая существенно упрощает процедуру получения мутантов и может быть применена при исследовании функций генов этих бактерий, а также при конструировании штаммов с заданными свойствами. Полученные в работе результаты могут послужить основой для дальнейшего развития созданной системы и ее адаптации для других бактерий. Высоко специфичная эндонуклеаза может быть использована для работы с прокариотическими геномами, в частности для внесения делений в хромосому . ГЛАВА 1. Сайтспецифическнс дезоксирибонуклеазы эндонуклеазы узнают в ДНК определенные последовательности нуклеотидов и расщепляют фосфодиэфирныс связи в строго определенных положениях по отношению к сайту узнавания. Эти ферменты узнают в ДНК специфичные палиндромные или нспалшадромные последовательности нуклеотидов длиной и. В присутствии Ме2 преимущественно 2 эндонуклеазы рестрикции расщепляют ДНК в определенных положениях внутри или рядом с узнаваемой последовательностью, или на неопределенном расстоянии иногда более п. При этом возможно образование 5выступающих, Звыступающих или спаренных, концов. Большинство ферментов этого класса расщепляет только двухцепочечную ДНК, однако некоторые из них, такие как vi, , , и др. ДНК, которая при этом принимает форму двухцепочечной шпилечной структуры . В настоящее время известно более эндонуклеаз рестрикции. ДНК и расщепляют только одну из цепей ДНК на определенном расстоянии от сайта. Впервые ферменты этого класса были найдены в близкородственных видах i. Три обнаруженные никазы . I и . ДНК г ртгаг и РаС1Депляют только верхнюю цепь ДНК на расстоянии четырех нуклеотидов от последовательности по направлению к Зконцу Абдурашитов и др. Железная и др. Как оказалось, все три фермента являются идентичными. ДНК семейство инвертаз , V , i, i, . Хинтеграз, а ТпЗрезолваза, iинвертаза из , iинвертаза фага Ми н др. Эти сайтспецнфичсские рекомбиназы используют механизм, схожий с тем, который использует топоизомераза I, расщепляя и воссоединяя одну цепь ДНК протомера ii , . Для топоизомераз I типа, участвующих в изменении степени суперскрученности ДНК, показана способность вносить одноцепочечные разрывы в ДНК. II типа при релаксации отрицательно супсрскрученных молекул ДНК гираза, образовании или развязывании узлов, образовании или разделении катенанов, вносят в ДНК двухцепочечные разрывы. При этом для некоторых из топоизомераз показано, что они оказывают предпочтение к определенным последовательностям и основаниям i , . ОРС хомингэндонуклеаз встречаются в интронах, интеинах и в свободностоящей форме между генами, что нашло отражение в номенклатуре этих ферментов. Общепринятая единая номенклатура хомингэндонуклеаз включает в себя а трехбуквенное родовидовое обозначение, состоящее из первой буквы родового названия и двух первых видового б последующую римскую нумерацию для отличия множественных ферментов из одного организма в приставки I I для интронных, I i I для интеиновых и i для свободностоящих , . Несмотря на высокую степень аминокислотной вариабельности, хомингэндонуклеазы подразделяются на четыре семейства на основе присутствия в их структуре следующих консервативных аминокислотных мотивов I, II, и i , . Семейства i и объединяют в единое суперсемейство на основании общей укладки каталитического центра представителей этих семейств i, . Наиболее многочисленным 0 членов и хорошо изученным является семейство I vi .