Изучение вторичной и третичной структуры рибосомных белков из малой 30S субчастицы Escherichia coli

• Автор: Гогия, Зураб Валерьянович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 206 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Структура малой субчастицы бактериальной рибосомы и ее компонентов

I. Универсальные принципы структурной организации

рибосом

1. Общая характеристика рибосом .

2. Построение рибосом из двух неравных субчастиц.

3. Другие характерные особенности структуры рибосом

4. Разборка и самосборка рибосомных субчастиц . .

П. Взаимное расположение белков и РНК в субчастице .

Ш. Структура компонентов субчастицы рибосом . .

1. Конформация РНК в растворе и в составе субчастицы
2. Состав и некоторые физикохимичесние характеристики рибосомных белков субчастицы Е.со. .
3. Конформация рибосомных белков в составе субчастицы рибосом .
4. Конформация изолированных рибосомных белков в растворе
У. Выделение индивидуальных белков из субчастицы рибосом
1. Введение
2. Экстракция рибосомных белков из субчастиц . .
3. Ионообменная хроматография белков из субчастицы рибосом
4. Сравнение методов выделения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Выращивание бактерий .
2. Выделение рибосом.
3. Выделение рибосомных субчастиц .
А. Выделение тотального белка рибосомных ЗОБ
субчастиц методом экстракции уксусной кислотой
5. Двумерный гельэлектрофорез белков ЗОБ субчастицы рибосом.
6. Полиакриламидный гельэлектрофорез рибосомных белков в К ацетатном буфере 4,5 в присутствии 6,5 М мочевины
7. Полиакриламидный гельэлектрофорез рибосомных белков в присутствии додецилсулъфата натрия в пластинах.
8. Хроматографические процедуры при фракциониро
. вании белков рибосомной ЗОБ субчастицы .
9. Концентрирование белковых препаратов
. Получение чистых препаратов индивидуальных рибосомных белков из малой ЗОБ субчастицы рибосом
. Выход индивидуальных белков и оценка чистоты полученных препаратов
. Определение ыконцевых аминокислот
. Анализ аминокислотного состава белков
. Равновесное центрифугирование
. Приготовление белков для физических исследований
. Определение концентрации белка в растворе . .
. Вычисление коэффициентов молярной экстинкции.
. Спектрофотометрические измерения .
. Измерение спектров кругового дихроизма .
. Определение вторичной структуры из спектров кругового дихроизма
. Спектры протонного магнитного резонанса
ПНР.
. Сканирующая микрокалориметрия
. Нейтронное рассеяние.
. Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Растворимость рибосомных белков
1. Введение
2. Постановка задачи
3. Подбор буферов для оптических исследований рибосомных белков
А. Подбор буферов для изучения третичной структуры рибосомных белков методами ПМРспектроскопии и нейтронного рассеяния 9з
5. Резюме.
П. Спектры поглощения в ближней ультрафиолетовой области и коэффициенты молярной экстинкции индивидуальных рибосомных белков из ЗОБ субчастицы
1. Постановка задачи .
2. Спектры поглощения индивидуальных белков в ближней ультрафиолетовой области
3. Коэффициенты молярной экстинкции индивидуальных белков ЗОБ субчастицы
III. Спектры кругового дихроизма индивидуальных белков ЗОБ субчастицы рибосом.
1. Введение. .
2. Постановка задачи
3. Характеристика спектров кругового дихроизма белков ЗОБ субчастицы рибосом .
4. Расчет содержания различных типов вторичной структуры белков ЗОБ субчастицы рибосом
IV. Третичная структура и компактность сердцевинных белков 4, 7, , и из малой субчастицы рибосом .i в растворе
1. Введение.
2. Конформация белка 4 в растворе
3. Конформация белка в растворе .
4. Конформация белка в растворе.
5. Конформация белка 8 в растворе.
6. Конформация белка в растворе.
V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Спектры поглощения рибосомных белков субчастицы
2. Вторичная структура рибосомных белков субчастицы
3. Третичная структура сердцевинных белков 4, 7,
8, И .
4. Заключительные замечания
ВЫВОДЫ V . 1бб
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


В опытах iiv и i vi было показано, что после завершения синтеза полипептида на рибосоме происходит диссоциация рибосом на субчастицы 3,4. Кроме того, есть веские основания считать, что определенная подвижность субчастиц в ассоциированном состоянии необходима для элонгационного процесса, так как избыточная стабилизация ассоциированного состояния рибосом ионами магния, спиртом, полиаминами и т. Каждая рибосомная субчастица имеет сложный набор разнообразных полипептидных цепей. Этот факт был обнаружен Уоллером при изучении белкового состава прокариотических рибосом 7, 8. Впоследствии множественность рибосэмных белков была показана и в эукариотических клетках 9. В настоящее время все входящие в состав рибосомы полипептиды могут быть охарактеризованы как индивидуальные белки 3. Рибосомные субчастицы могут быть рассмотрены, как рибонуклеопротеидные тяжи, свернутые в компактную структуру. Этот принцип структурной организации рибосом был открыт и сформулирован после обнаружения у рибосомных субчастиц способности разворачиваться в рибонуклеопротеидные тяжи в безмагниевом гипотоническом растворе, причем скольнибудь заметной потери белков в процессе разворачивания не происходило , 8, . При разворачивании происходит резкое уменьшение коэффициентов седиментации субчастиц и увеличение удельной вязкости. Было установлено, что разворачивание рибосомных субчастиц представляет собой многоступенчатый процесс , 5, 2, 2, , 9, , 0, 5. Таким образом, оказалось, что белковые молекулы могут удерживаться на рибосоыной РНК не зависимо от нативной четвертичной структуры рибосомных субчастиц. Следовательно, рибосомная РНК может рассматриваться как ковалентнонепрерывный каркас, специфическая структура которого определяет уникальное расположение рибосомных белков , , 8, , 2. При обработке интактных рибосомных частиц высокими концентрациями солей одновалентных металлов, происходит диссоциация рибосомных белков 9, 7, I, , 5, 0. Белки диссоциирующие под воздействием высоких концентраций солей в присутствии ионов 2 получили название дополнительных рибосомообразующих или отщепляемых i белков, а белки, которые отщепляются при воздействии высоких концентраций соли только в отсутствие ионов магния получили название основных структурных или сердцевидных белков , 9, 5, 0. Отщепление рибосомных белков под действием высоких концентраций солей протекает довольно дискретными группами 9, , 5. Диссоциация одних белков вызывает более легкое отщепление других белков . Следует отметить, что порядок диссоциации рибосомных белков изменяется при добавлении мочевины в солевой раствор 5. Порядок диссоциации белков также изменяется, если диссоциацию проводить с помощью уксусной кислоты 1. Процесс, обратный разборки. I и белковых молекул, 3 процессе самосборки субчастиц особенно отчетливо проявляется каркасная роль рибосомной РНК, В работах 8, впервые было показано, что белокдефицитные РНПчастицы, образующиеся в клетках . Затем, были найдены условия, в которых биологически активные и субчастицы были реконструированы из свободной рибосомной РНК и свободных рибосомных белков 0, 0, , 5. Подробное исследование процесса самосборки субчастицы рибосом Е. Сначала к I6 РНК присоединяются белков, вследствие чего получаются так называемые частицы. Эти частицы присоединяют остальные белков только после активирования iчастиц. При активации Н1частиц, которая осуществляется прогреванием при С, происходит перестройка РНПтяжа , 1, . При исследовании взаимодействия индивидуальных рибосомных белков субчастицы с I6 РНК оказалось, что ряд белков 4, 7, 8, , , , способен непосредственно присоединиться к I6 РНК, тогда как остальные белки связываются только с РНКбелковым комплексом. Путем реконструкции ЗОБ субчастицы в отсутствии одного или нескольких белков были получены различные РНПчастицы, изучен их белковый состав и таким образом определены взаимосвязи между белками во время реконструкции, что позволило составить карту реконструкции ЗОБ субчастицы 1, , 8. Близкое расположение белков на карте реконструкции часто отражает их физическую близость в ЗОБ субчастице .