Видовая идентификация ортопоксвирусов и обнаружение мутаций, обусловливающих устойчивость Mycobacterivm tvbercvlosis к рифампицину, гибридизацией на олигонуклеотидных микрочипах

• Автор: Лапа, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил

Введение.

1. Литературный обзор

1.1. Использование метода гибридизации на биологических микрочипах для решения задач клинической диагностики и фундаментальных исследований

1.1.1. Технологии производства биологических микрочипов.

1.1.2. Гибридизация па биологических микрочипах. Разнообразие задач и подходов к га выполнению.
1.1.3. Методы регистрации гибридизационного сигнала и увеличения чувствительности анализа.

1.1.4. Методы повышения эффективности гибридизации на биологических микрочипах.

1.1.5. Заключение.

1.2. Возубудитсли туберкулеза и оспы как бактериальная и вирусная

модели для разработки диагностических систем, основанных на гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами. Медицинское значение выбранных объектов.
1.2.1. i i.
1.2.2. Ортопоксвирусы.
1.2.3. Заключение.
2. Материалы и методы.
2.1. Образцы М. i и ортопоксвирусов
2.1.1. М. i
2.1.2. Ортопоксвирусы.
2.2. Секвенированис образцов
2.3. Олигонуклеотиды и праймеры.
2.4. Подготовка образцов для гибридизации на микрочипе
2.4.1. М. i
2.4.2. Ортопоксвирусы.
2.5. Биологический микрочип.
2.6. Гибридизация.
2.6.1. ТБбиочип
2.6.2. Биочип для видовой идентификации ортопоксвирусов.
2.7. Регистрация результатов
2.8. Измерение кривых плавления и кинетики образования дуплексов.
Вычисление температуры плавления дуплексов.
2.9. Контроль качества микрочипов.
2 Статистическая обработка результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка методологии гибридизационного анализа на
биологических микрочипах.
3.1.1. Конструирование праймеров. Анализ кинетических и
термодинамических параметров тшвления ДИКДНК дуплексов в условиях
микрочипа. Выбор оптимального состава геля.
3.1.2. Подготовка образца для анализа.
3.1.3. Контроль качества микрочипов.
3.2. Разработка биологического микрочипа для идентификации штаммов
М. i, устойчивых к рифампицину
3.2.1. Гибридизация на ТБбиочипе.
3.2.2. Чувствительность и специфичность метода
3.2.3. Оптимизация процедуры гибридизации па ТБбиочипе для практи ческих лабораторий
3.2.4. Статистическая обработка результатов.
3.2.5. Разработка двухпараметрической системы анализа результатов гибридизации.
3.2.6. Применение разработанного ТБбиочипа для целей диагностики и эпидемиологических исследований. Статистика распределения мутаций
3.3. Разработка биологического микрочипа для видовой идентификации ортопоксвирусов
3.3.1. Выбор мишени для видовой идентификации ортопоксвирусов
3.3.2. Структура биочипа
3.3.3. Гибридизация.
3.3.4. Мультиплексная гибридизация как подход к повышению надежности результатов.
3.3.5. Использование гибридизации на микрочипе для видовой идентификации ортопоксвирусов в качестве ускоренного метода.
Заключение.
Выводы.
Благодарности
Список литературы


Наибольшее значение применение таких методов приобретает в случаях, когда требуется в кратчайшие сроки проанализировать образец на присутствие болезнетворного агента, например, для ограничения распространения высоко контагиозных заболеваний, либо, если диагностика классическими культуральными методами трудоемка и занимает продолжительное время при туберкулезе бактериологическое подтверждение клинического диагноза занимает месяца. Изучение генетических детерминант устойчивости исследуемых объектов к лекарственным препаратам позволяет в качестве аналитической мишени использовать нуклеиновые кислоты, что сразу же ставит чувствительность анализа на принципиально иной уровень, благодаря возможности применения ПЦР. Биологические микрочипы представляют собой платформу с огромным потенциалом для разработки таких аналитических систем, тем самым определяя приоритетность данного направления исследований. Применение гибридизациониого анализа на олигонуклеотидных микрочипах не только упрощает процедуру исследования, но и предоставляет принципиально новые возможности для одновременной идентификации и изучения целого ряда генетических локусов микроорганизмов и вирусов. Целью данной работы явилась разработка методов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе и создание универсальной методологии конструирования диагностических систем для идентификации патогенных агентов и анализа их устойчивости к лекарственным препаратам. В качестве объектов в настоящем исследовании были использованы возбудители социально опасных инфекций туберкулеза и оспы бактериальной и вирусной природы, соответственно. Сформулированы основные критерии методологии генетического анализа коротких фрагментов бактериальной и вирусной ДНКмишени методом гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, обладающие достаточной универсальностью и рассматривающие такие аспекты как конструирование праймеров, пробоподготовка, гибридизация, интерпретация результатов и способы повышения их надежности. Предложена мультиплексная гибридизация на микрочипе как средство повышения надежности результатов. Впервые сконструирован микрочип, позволяющий достоверно и в кратчайшие сроки проводить детекцию и видовую идентификацию оргопоксвирусов в исследуемом образце. Сконструирован микрочип, позволяющий проводить детекцию около всех фенотипически устойчивых к рифампицину штаммов М. Ьегси1ои. Все вышесказанное подтверждает универсальность разработанной методологии гибридизации на биологических микрочипах, что позволяет применять ее для генетического анализа широкого спектра биологических объектов. Литературный обзор. Использование метода гибридизации на биологических микрочипах для решения задач клинической диагностики и фундаментальных исследований. Явление гибридизации нуклеиновых кислот известно практически со времен предложенной Уотсоном и Криком теории спирального строения ДНК и является фундаментом современных представлений о ее вторичной двухцепочечной структуре. С тех пор изучение механизмов гибридизации и попытки использования этого феномена в практических целях стали весьма привлекательной задачей для широкого круга исследователей с целью установления генотипических характеристик изучаемых объектов, что позволило получать информацию об устройстве биологических систем непосредственно из первых рук. Одним из первых вариантов применения гибридизации стало определение степени родства различных организмов методом сравнения последовательностей нуклеиновых кислот. Так появилось новое направление таксономии гсносистематика. Этод подход заключается в том, что двойная спираль ДНК денатурируется нагреванием, и ее разошедшиеся цепи фиксируются. При понижении температуры становится возможной ренатурация цепей, причем соединиться с одноцепочечной ДНК может лишь комплементарная ей цепь. Количество ренатурированной двуспиральной ДНК служит прямой мерой генетического родства сравниваемых организмов. При определении гомологии ДНК сравнивают полные геномы изучаемых организмов. С помощью метода молекулярной гибридизации ДНК показана большая гетерогенность практически всех крупных таксонов.