BGL2P и GAS1P-основные глюкантрансферазы, формирующие молекулярный ансамбль клеточной стенки дрожжей

• Автор: Плотникова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.6.

I.ВВЕДЕНИ Е.7.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глюканазы и их роль в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей.

1. Введение.

2. Молекулярная организация клеточной стенки дрожжей

2.1. Глюкан.

2.2. Хитин

2.3. Маннопротеины

2.3.1. Ыманнозилирование.

2.3.2.0маинозилирование

2.3.3. Белки, содержащие гликозилфосфоинозитольный якорь.
2.4. Связь макромолекул в составе клеточной стенки дрожжей
2.4.1. Ковалентные связи между полисахаридными компонентами в составе клеточной стенки дрожжей
2.4.2. Типы встраивания белков в клеточную стенку дрожжей.
2.4.3. Модульная организация клеточной стенки дрожжей.
3. Известные глюканазы дрожжей основные характеристики.
3.1. Семейство .
3.2. Семейство 6Н.
3.3. Семейство бИ6.
3.4. Семейство ОН.
3.5. Семейство
4. Регуляция экспрессии генов, кодирующих ферменты, обладающие глюканазной
активностью.
4.1. Зависимая от клеточного цикла регуляция экспрессии генов глюкаиаз .
4.2. Стресс индуцируемая регуляция экспрессии генов
5. Функции ГЛЮКАИАЗ
6. Заключение и постановка задач исследования
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Используемые в работе реактивы
2. Штаммы микроорганизмов и условия их выращивания
3. Состав сред, используемых для культивирования микроорганизмов .
3.1. Среды для выращивания Е.со
3.2. Среды для выращивания дрожжей
4. Использованные в работе плазмиды.
5. Определение чувствительности дрожжей к присутствию в среде
культивирования Конго красного и додецилсульфату натрия
6. Трансформация клеток . i.
7. Трансформация клеток дрожжей.
8. Выделение плазмидной ДНК из клеток . i.
9. Выделение суммарной ДНК дрожжей
. Электрофоретические методы
.1. Электрофорез в агарозном геле.
.2. Электрофорез белков в денатурирующих условиях.
. Вестернблот анализ.
. Окраска белков при помощи Кумасси.
. Окраска белков при помощи нитрата серебра.
. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения.
. Полимеразная цепная реакция Г1ЦР
. Выделение клеточных стенок дрожжей
. Обработка клеточных стенок протеиназой К
. Экстракция белков из предварительно биотинилированных клеточных стенок дрожжей .,
. Выделение глюкантрансферазы 2 из клеточных стенок дрожжей .
. Приготовление тотальных препаратов внутриклеточных белков.
.Фракционирование клеток для получения препаратов белков изолированной плазматической мембраны и внутриклеточного содержимого.
. Измерение суммарного белка в препарате
.1 Определение концентрации белка по Брэдфорду , .
.2 Определение концентрации белка по Лоури vv .,
. Измерение суммарного клеточного белка микробиуретовый метод.
. Анализ карбоксипептидазы
. Анализ глюкозоксидазы, секретируемой клетками . .
. Электронномикроскопические методы
.1 Электронная микроскопия клеток дрожжей.
.2 Электронная микроскопия фибрилл, сформированных с участием глюкантрансферазы
. Спектроскопия кругового дихроизма.
. Изучение связывания красителя Конго красного КК.
. Изучение связывания флуоресцентного красителя ivi Т .
. Прочие методы.
ЗОЛ В ходе работы применяли стандартные методики частной генетики
дрожжей.
.2 Определение количества полисахаридных компонентов в изолированных КС
дрожжей.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Получение изогенных штаммов дрожжей vii с делениями
генов 2 и 1, а так же с одновременным нарушением обоих указанных генов.
2. Сравнительный фенотипический анализ полученных штаммов
vii с нарушенными генами 2 и
3. Получение и характеристика штамма дрожжей , лишенного
гена 2.
4. Получение штамма дрожжей с нарушенной
глюкантрансферазой
4.1. Анализ белков клеточной стенки мутанта.
4.2. Анализ белков цитоплазматической мембраны мутанта
4.3. Анализ вакуолярного белка карбоксипептидазы
4.4. Анализ секретирусмого белка глюкозооксидазы ГО.
4.5. Фенотипический анализ штамма дрожжей Я. .
5. Выявление нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей .
vii в отсутствии глюкантрансфераз I2 и
6. Изучение коиформационных особенностей глюкантрансферазы 2 дрожжей
. vii.
6.1. Подбор условий для экстракции 2 из клеточной стенки в нативной конформации
6.1.1. Экстракция 2 с помощью глюканазы.
6.1.2. Экстракция 2 с помощью мягких термических обработок
6.2. Физикохимические характеристики фибрилл, образованных i vi глюкантрансферазой I2.
6.2.1. Опрсделние вторичной структуры глюкантрансферазы 2.
6.2.2. Связывание Конго Красного
7. Изучение физиологической роли белка 2 дрожжей vii,
способного формировать амилойдные фибриллы0.
V. ВЫВОДЫ6.
Список литературы


В значительной степени это связано с тем, что даже комбинированные делеции глюканаз не легальны для клетки и не характеризуются яркими фенотипическими проявлениями. Скудные фенотипические проявления делеции глюканаз могут объясняться несколькими причинами. Вопервых, в дрожжах . Она приводит к тому, что в ответ на делеции многих генов, в том числе кодирующих глюканазы, дрожжевая клетка увеличивает активность хитинсинтетаз и таким образом повышает количество хитина в латеральной клеточной стенке. Л новообразованный хитин в свою очередь способен реиарировать нарушения клеточной стенки, вызванные отсутствием фермента, ген которого был нарушен. Вторая причина, по которой делеции глюканаз могут не характеризоваться серьезными морфологическими изменениями КС, это возможная взаимная компенсация их функций. Можно предположить, что существует не одна, а как минимум две основные глюканазы, и только их совместная делеция критична для жизнеспособности дрожжевой клетки. Однако до настоящего времени не было выявлено такого сочетания делений генов глюканаз, которое бы приводило к серьезным нарушениям КС. По нашему мнению предпочтительными кандидатами на роль основных ферментов, участвующих в формировании клеточной стенки, являются две глюканазы, обладающие также глюкантрансферазной активностью, а именно 2 и 1р. Обе эти глюкаитрансферазы обнаруживаются на клеточной поверхности на всех стадиях клеточного цикла. Экспрессия генов, кодирующих эти ферменты, активируется в периоды серьезных перестроек клеточной стенки, а также в стрессовых условиях, сопровождающихся нарушением целостности клеточной поверхности vi, . Несмотря на то, что независимые делеции генов и 2 не приводят к катастрофическим нарушениям организации клеточной стенки и гибели клеток, отсутствие кодируемых ими глюканаз сопровождается у дрожжей vii увеличением содержания в КС хитина Vivi . Все указанные факты являются косвенным свидетельством того, что 2 и играют важную роль в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей. Целью настоящей работы являлось выявление роли глюкантрансфераз 2 и в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей. Получить штаммы дрожжей vii и с делениями генов 2 и 1, а так же с одновременным нарушением обоих указанных генов. Провести сравнительный фенотипический анализ полученных штаммов. Выявить возможные нарушения встраивания белков в клеточную стенку дрожжей в отсутствии глюкантрансфераз 2 и . Изучить конформационные особенности шокантрансферазы I2. II. МОЛЕКУЛЯРНОГО АНСАМБЛЯ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЖЖЕЙ. Глюканазы ферменты, способные вносить разрывы в молекулы полисахарида глюкаиа, состоящего из остатков глюкозы. В настоящий момент под термином глюканазы объединяют несколько типов белков, обладающих как истинной глюканазной, так и в некоторых условиях глюкаптрансферазной активностью, которая подразумевает не только способность гидролизовать уже существующие ковалентные связи между молекулами глюкозы, но и образовывать новые . В клетках дрожжей идентифицировано большое количество ферментов, обладающих глюканазной активностью см. Такие ферменты обнаруживаются в цитоплазме i, , плазматической мембране Vi, , встроенными в клеточную стенку . Несмотря на это глюкан основной субстрат для данных ферментов локализуется исключительно на клеточной поверхности, за пределами цитоплазматической мембраны, и является основным сгруктуриым компонентом такой важной для клетки дрожжей органеллы как клеточная стейка КС . В связи с выше сказанным, логично полагать, что где бы ни была локализована гшоканаза, реализовать свою ферментативную активность она может только в клеточной стенке. Следовательно, для того чтобы понять биологическое предназначение глюканаз для клеток дрожжей в целом, необходимо понять какую роль играет процесс перестройки глюкановых молекул а именно эту реакцию осуществляют ферменты, обладающие глюканазнойглкжантрансферазной активностью для формирования молекулярного ансамбля клеточной стенки. В следующем разделе мы подробнее остановимся на рассмотрение молекулярной организации клеточной стенки дрожжей.