Искусственные ДНК-содержащие супрамолекулярные комплексы

• Автор: Позмогова, Галина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 203 с. : ил.

1. Супрамолекулярныс конструкции для направленного транспорта в клеткимишени фрагментов полинуклеотидов ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Почему нужны невирусные системы доставки.

1.2. Интернализация олигонуклеотидов

1.3. Что подразумевается под направленным транспортом чужеродной ДНК

1.4. Физические методы доставки ДНК.

1.5. Химические методы доставки ДНК.

1.6. Биохимические методы доставки ДНК

1.6.1. Поиск специфических лигандов.

1.6.2. Низкомолекулярные органические лиганды.

1.6.3. Асиалогликопротеины

1.6.4. Белковые и пептидные лиганды.

1.6.4.1. Пептиды
1.6.4.2. Природные и рекомбинантные белки.
1.6.4.3. ДНКсвязывающис домены.
1.6.4.4. Эндосомолитичсские домены
1.6.4.5. Ядерный импорт.
1.7. Основные принципы архитектуры иуклеопротеиновых транспортных комплексов
2. Искусственные ДНКсодержащие супрамолекулярные комплексы ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
2.1. ДНКкомпоиента комплексов
2.1.1. Олигонуклеотиды, несущие тиофосфорильные модификации заданной локализации
2.1.2. Конформационные исследования олигонуклеотидов
2.1.3. Флуоресцентномеченные олигонуклеотиды
2.1.3.1. Некоторые особенности хроматографического поведения модифицированных олигонуклеотидов
2.1.3.2. Трансформация гексахлорфлуоренилового остатка в составе олигонуклеотидов в условиях аммонолиза.
2.2. Нуклеопротсиновые комплексы для доставки чужеродной ДНК в клеткимишени .
2.2.1. Ковалентные нуклеопротеиновые конъюгаты
2.2.1.1. Ковалентные конъюгаты ЭФРч с антисмысловыми олигонуклеотидами
2.2.1.1.1. Получение белка рЭФРч
2.2.1.1.2. Синтез ЭФРчолигонуклеотидных конъюгатов.
Сравнение митогенной активности белка ЭФР, рекомбинантного ЭФРч
и конъюгатов ЭФРААСОГГОАСЮСЮСАТ и ЭФР
ААТССТСССССАСТТСАССС
Влияние конъюгата ЭФР ААССТГОАОССССАТ на подавление экспрессии генамишени Стус
2.2.1.2. Синтез конъюгатов АФПолигомер
2.2.2. Белковые векторыпереносчики ДНК.
2.2.2.1. Получение белковых векторов химической конденсацией доменов
2.2.2.1.1. Синтез конъюгата АФПполилизин.
Получение комплекса АФПполилизинолигонуклеотид
Исследование уровня эидоцитоза олигонуклеотидов опухолевыми клетками в составе конъюгата с АФП и комплекса с полипептидом
АФПполилизин.
Анализ распределения конъюгата АФП с флуоресцентномеченным антисмысловым олигонуклеотидом в опухолевых клетках с помощью
флуоресцентной микроскопии
Сравнение уровня эндоцитоза конъюгата АФПРА и комплекса АФГ1полилизинРАБ
2.2. Рекомбинантные белковые векторыпереносчики полинуклеотидов
2.2.2.2.1. Рекомбинантный белок дифтерийный токсинстрептавидин.
Основные требования к структуре белковых векторов
.2. Структура белкового рекомбинантного переносчика ДНК,
2.2.2.2.3. Получение белка .
2.2.2.2.4. Структурная организация и свойства супрамолекулярных ДНК и ДНК комплексов
опосредованная доставка чужеродной ДНК в целевые клетки
Влияние на доставку олигонуклеотидов.
Увеличение активности антисмысловых олигонуклеотидов в
присутствии
Сравнение митогенной активности белков ЭФРч, и комплексов
с олигонуклеотидами
Исследование интернализации олигонуклеотидов ТМО и в составе комплексов с с помощью проточной цитометрии и
флуоресцентной микроскопии
Внутриклеточная локализация олигонуклеотидов.
Исследование цитотоксичности комплексов с ТМО и i vi Влияние вектора на доставку репортерной плазмиды 1 в
опухолевые клетки
Структурная организация комплексов с олигонуклеотиами
Изучение динамики молекул в комплексе с олигонуклеотидами
разной структуры.
Изучение комплексов ДНК с помощью собственной УФ
флуоресценции белка.
Изотермы адсорбции молекул на олигонуклеотидах ТМО и 2 Изучение структуры биологически активных комплексов ДНК .
Влияние молекул на вторичную структуру олигонуклеотидов
Получение и свойства белкавектора .
2.3. Искусственные ДНКассоциаты с живыми клетками
2.3.1. Выбор структуры амфифильных производных олигонуклеотидов
2.3.2. Синтез олигонуклеотидных производных жирных кислот
2.3.3. Фиксация жирнокислотных производных олигонуклеотидов на поверхности живых клеток
2.3.4. Гибридизационные свойегва ДНКмодифицированных клеток
2.4. Супрамолекулярные комплексы наночастиц никеля с олигонуклеотидами
и белками.
2.4.1. ДНКассоциаты наночастиц никеля.
2.4.2. Ассоциаты наночастиц никеля с белками.
2.4.3. Взаимодействие i с связывающими ДНКаптамерами и 2.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4. ВЫВОДЫ.
5. ЛИТЕРАТУРА.
6. ПРИЛОЖЕНИЕ Акты о внедрении в производство разработок диссертанта 6
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
зеленый флоресцирующий белок
стеклянные шарики с контролируемым размером пор
СуЗ индодикарбоксицианин
диметилсульфоксид
4, 4диметокситритил
, дитиотреитол
рецептор эпидермального фактора роста Ыбмалеимидокапроилокси сукцинимид 6флуоресцеинил6карбоксиамидогексил гидроксиэтил1 пи неразинэтаисульфоки слота X 4,7,2,,4,,5,7гексахлорфлуоресцеинил6карбоксиамидогексил I лазерная десорбционноионизационная времяпролетная массспектрометрия с участием матрицы сигнал ядерной локализации гидроксисукцинимид
i i i i полимеразная цепная реакция в реальном времени додсцилсульфат натрия
гидроксисукцинимид приридилдитио пропионовой кислоты
АФП альфафстопротеина человека
БСА, бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ДМАП ТТДдиметиламинопиридин
КД круговой дихроизм
ГТААГ полиакриламидный гель
Трис трисгидроксиметиламинометан
ФСБ, фосфатносолевой буфер
ХИПФ НЕХизопропилфосфата
ЭФРч, эпидермальный фактор роста человека
I среднее значение интенсивности флуоресценции клеток.
ВВЕДЕНИЕ


Антисмысловой олигонуклеотид должен найти ту мРНК или участок хромосомной ДНК, против которой он направлен, а вводимый ген должен войти в состав конструкции, способной экспрессировать его продукт, и оказаться в соответствующем компартменте клетки. Очевидно, что генетический материал сам по себе этими способностями не обладает. При введении в организм он не попадет преимущественно к нужной ткани или к нужному органу. Та часть генетического материала, гидрофильного по своей природе, которая окажется в нужном месте, лишь в незначительной мере сможет пересечь гидрофобную клеточную мембрану. Оказавшись внутри клетки, чужеродная ДНК может локализоваться не там, где это необходимо, и, более того, оказаться в лизосомах и гидролизоваться нуклсазами. Следует отметить, что очень важно предотвратить попадание экзогенного генетического материала в другие, не нуждающиеся в трансформации, клетки организма. В настоящее время ни одна из невирусных систем доставки ДНК не в состоянии обеспечить решение всей совокупности перечисленных проблем. Среди невирусных методов доставки ДНК принято различать физические, химические и биохимические. ДНК, трансплантацию клеточного матрикса, несущего адсорбированный генетический материал . В связи с развитием нанотехнологии активно разрабатываются новые оригинальные приемы местного введения терапсатически значимого генетического материала. Недавно предложено упаковывать полинуклеотиды и i в углеродные нанотрубки, которые легко проникают в клетку . Для получения наночастиц используют, в том числе, модифицированные липиды . ДНК содержащих частиц диаметром 0 нм . ДНК с участием октааргининмодифицированных липидов. Показано, что супрамолекулярная система интернализуются макропиноцитозом, минуя липосомальную деградацию. Для упаковки ДНК предложено также использовать природный полимер хитозан. РНК в виде 0 нм частиц ассоциатов олигонуклеотидов с фракционированным хитозаном 4 и 0 . Следует отметить, что хитозановые комплексы с плазмидной ДНК оказались значительно менее эффективными и более цитотоксичными в сравнении с ассоциатами той же ДНК с хитозаном, модифицированным остатком фолиевой кислоты . Заметное место среди химических подходов к доставке генетического материала занимают разнообразные варианты липофекции или липосомального транспорта. Липидная оболочка защищает полинуклеотиды при контакте с биологическими жидкостями от ферментативной деградации, липосомы неиммуногенны, легко проникают из сосудов к тканям. Их свойства зависят от липидного состава, размера липосомы или везикулы, природы инкапсулированной молекулы, адресующего лиганда и способа его присоединения. Нзависимые липосомы, благодаря включению в их состав фузогенных белков, например, гемагтлютинина или НУД белка вируса Сендай , теряют стабильность в слабокислой среде. Некоторые авторы считают перспективным использовать липосомы именно такого типа для транспорта ДНК и олигонуклеотидов в цитоплазму. В этом случае полинуклеотид должен быстро освободиться от липидной оболочки в эндосоме и с большей вероятностью может оказаться в цитоплазме, не подвергаясь расщеплению в лизосомах. Значительные успехи в этой области связаны с применением для транс1юртЧКкатЮнь1ХЛмдовНЗКотопыхв сочетании нейтральными молекулами типа диолеилфосфагидилэтаноламина, формируют катионные везикулы, эффективно удерживающие ДНК за счет электростатических взаимодействий , , , . Кроме ставших уже традиционными компонентов катионной липофекции, недавно для увеличения эффективности доставки ДНК в клетки предложено использовать амипогликозидные и полилизиновые производные липидов . Сравнение уровней экспрессии репортерного белка клетками, трансфицированными катионной липофекцией, комплексами ДНКполилизин и ДНКполилизинлипидп, показало преимущество последних . Органоспецифичность липофекции может обеспечиваться при введении препарата в различные участки органов или кровеносной и лимфатической системы, ткансспецифичиость при подборе специальных лигандов. В последние годы предпринимаются попытки придать избирательность катионным липосомам включением в их состав различных пептидных и белковых производных , , , .