Антитела против синтетических пептидных фрагментов прионного белка для выявления клеточного приона и его патогенной изоформы

• Автор: Обозная, Мария Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Антитела к прионному белку

методы получения и области применения

1.1. Прионныс болезни

1.2. Структура прионного белка

1.3. Методы получения антител к прионному белку

1.3.1. Иммунизация выделенным прионым белком

1.3.2. Иммунизация трансгенных бесприонных мышей

1.3.3. Иммунизация рекомбинантным прионнмм белком

1.3.4. ДНКиммунизация
1.3.5. Иммунизация синтетическими фрагментами прионного белка, конъюгированными с белкомносителем
1.3.6. Иммунизация мультиантигенными пептидными комплексами
1.3.7. Иммунизация свободными неконъюгированными синтетическими фрагментами прионного белка
1.4. Области применения антител к прионному белку
1.4.1. Методы иммунодиагностики прионных болезней
иммунодетекция прионного белка
1.4.2. Подходы к иммунопрофилактике и иммунотерапии
прионных болезней исследования i vi
1.4.3. Подходы к иммунопрофилактике и иммунотерапии
прионных болезней исследования i viv
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕ1ШЕ
2.1. Выбор пептидов в последовательности прионного белка
2.2. Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка у кроликов
2.2.1. Изучение иммуногенной активности свободных синтетических пептидов и их конъюгатов с белкомносителем
2.2.2. Получение рекомбинантного прнонного белка
2.2.3. Изучение связывания противопептидных антител кроликов
с рекомбинантным прионным белком
2.2.4. Изучение связывания противопептидных антител кроликов
с РгРБс и РгРС изоформами прионного белка, выделенными из клеток
2.2.5. Исследование способности противопептидных антител кроликов выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте
2.2.6. Препятствие накоплению патогенного приона в культуре клеток
в присутствии противопептидных кроличьих антител
2.3. Получение и характеристика антител к синтетическим фрагментам прионного белка у мышей
2.3.1. Изучение иммуногснной активности синтетических пептидов
и их аналогов при иммунизации мышей трех линий
2.3.2. Изучение связывания противопептидных антител мышей
с рекомбинантным прионным белком
2.3.3. Исследование способности противопептидных антител мышей выявлять патогенный прионный белок в иммуногистохимическом тесте
2.4. Получение и характеристика моноклональных антител
к прионному белку у мышей
2.4.1. Получение моноклональных антител к синтетическим
пептидам прионного белка
2.4.2. Получение моноклональных антител к рекомбинантному прионному белку
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Химические реагенты и биологические препараты
3.2. Оборудование и расходные материалы
3.3. Культуры клеток
3.4. Животные
3.5. Получение конъюгатов пептидов с КЬН или с овальбумином
3.6. Получение рекомбинантного прнонного белка КРС
3.7. Иммунизация животных
3.7.1. Иммунизация кроликов
3.7.2. Иммунизация мышей для получения иммунных сывороток
3.7.3. Иммунизация мышей для получения моноклональных антител
3.8. Получение сывороток крови
3.9. Твердофазный иммуноферментный анализ ИФА
3 Получение моноклональных антител
. Ведение клеточных культур
. Замораживание и размораживание клеток
. Выделение мышиных перитонеальных макрофагов
. Получение гибридом
. Скрининг и клонирование гибридом
. Культивирование гибридом для наработки антител
. Изотипирование антител
3 Выделение РгР из клеток нейроблаезомы.
. Выделение РгР из клеток 2
. Выделение РгРсиз клеток 2
3 Электрофорез и иммуноблоттинг
. Электрофорез и иммуноблотгинг, метод 1 рис. 2.3, 2.9, 2.
. Электрофорез и иммуноблоттинг, метод 2 рис. 26, 2.8
3 Изучение влияния иммунных сывороток на содержание
патогенного приона в культуре клеток
. Схема эксперимента и иммуноблоттинг образцов
. Количественный дотблоттинг образцов
. Иммуноцитохимический анализ
3 Иммуногистохимический тест
3 Аффинная очистка антител
. Аффинная очистка
. Трипсинолиз очищенных антител и
массснсктрометричсский анализ фрагментов
3 Определение аффинности антител
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящем исследовании для получения антител к прионному белку мы предлагаем использовать неконъюгированные с бслкомноситслем синтетические фрагменты белка. Такой подход позволит направленно получить антитела к выбранным структурно и функционально важным участкам белковой цепи. Кроме того, этот метод позволит избежать нежелательных иммунных реакций, возникающих при традиционной иммунизации пептиднобелковыми конъюгатами. Таким образом, диссертационная работа посвящена получению с помощью синтетических пептидов и рекомбинантного белка поликлональных и моноклональных антител, направленных к определенным структурнофункциональным районам прионного белка,способных выявлять изоформы прионного белка, а также обладающих потенциальным иммунотерапевтическим действием. Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии, или прионные болезни это неизлечимые нейродегснеративные заболевания, поражающие человека и некоторые другие виды млекопитающих. В настоящее время известно четыре болезни человека болезнь КрейтцфельдтаЯкоба, куру, синдром ГерстманнаШтреусслераШейнксра, фатальная семейная инсомния, и шесть болезней животных скрепи овец и коз, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота так называемое бешенство коров, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь оленей и лосей, губкообразная энцефалопатия кошек и губкообразная энцефалопатия экзотических копытных 1,2. Необычность этих болезней заключается в том, что инфекционный агент не является бактерией или вирусом, а представляет собой белковую молекулу патогенную изоформу РгР нормального клеточного прионного белка РгРс 3. Прионный белок закодирован в геноме млекопитающих и экспрессируется на поверхности многих клеток организма, а больше всего прионной мРНК найдено в нейронах . Проникновение инфекционного агчлгга белка РгР5с вызывает превращение нормального РгРс белка хозяина в патогенный белок с последующим накоплением его агрегатов. В дальнейшем происходит массовая гибель нейронов, поэтому срезы больного мозга на терминальных стадиях болезни содержат характерные губкообразные изменения. Заражение ирионами человека и животных обычно происходит при упогреблении пищи, содержащей инфекционный материал. Так, например, причиной возникновения эпидемии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Великобритании считают использование в рационе скота мясокостной муки, приготовленной из больных животных. В свою очередь, употребление людьми заражнной говядины считают причиной появления неизвестной рапсе разновидности болезни КрейтцфельдтаЯкоба, так называемого нового варианта этой болезни 1, 8. А болезнь куру, ранее встречавшуюся у жителей Океании, связывают с ритуальным каннибализмом 9. Заражение также может происходить ятрогенным путем, например, через недостаточно стерилизованные нейрохирургические инструменты. Экспериментальное заражение лабораторных животных производится путем интраперитонеалыюго, перорального или интрацеребрального введения гомогената мозга больного человека или животного здоровому животному. Развитие губкообразных энцефалопатий, не связанное с проникновением инфекции, имеет наследственный или спорадический характер. Семейная форма болезни КрейтцфельдтаЯкоба, фатальная семейная инсомния, синдром ГерстманнаШтреусслераШейнкера вес эти болезни человека являются наследственными и связаны с врожднными мутациями в гене прионного белка 2. К спорадической форме приониых заболеваний относится большинство случаев болезни КрейтцфельдтаЯкоба, когда у пациентов с характерными клиническими проявлениями болезни не находят генетических изменений. Возможной причиной возникновения спорадической болезни КрейтцфельдтаЯкоба считают спонтанное или обусловленное соматическими мутациями превращение белка РгРсвРгР1. Неотъемлемым морфологическим признаком болезни является накопление агрегатов белка РгР5с приониых фибрилл и амилоидных бляшек в тканях головного мозга 1, . Но в условиях отсутствия или прекращения экспрессии РгРс агрегаты РгР не оказывают патологического действия у лабораторных животных , . Эти и многие другие данные свидетельствуют о том, что механизм патогенеза приониых заболеваний пока до конца не выяснен.