Механизм регуляции активности 2'-фосфодиэстеразы в культуре клеток NIH 3Т3

• Автор: Карташева, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. 2Фосфодиэсгераза.

1.1.1. Понятие о системе 2.болиго

аденилата.
1.1.2. 2Фосфодиэстераза выделение и очистка, физикохимические свойства и субстратная специфичность.

1.1.3. Динамика активности 2фосфодиэс

теразы при действии интерферона

1.2. Углубление клеток в состояние покоя, особенности метаболизма и предполагаемая роль

2 , 5 олигоаденилата

1.2.1. Понятие о состоянии покоя
1.2.2. Роль з,5сАМР в регуляции процессов пролиферации.
1.2.3. Система 2,5олигоаденилата при
углублении клеток в состояние покоя
1.3. Регуляция активности ферментов фосфорилированием.
1.3.1. Ферменты, осуществляющие фосфорилирование.
1.3.2. сАМРзависимая цротеинкиназа
1.3.3. Механизмы регуляции ферментативной активности сАМРзависимым фосфорилированием
1.3.3.1. Регуляция активности ингибитора
типа I протеинфосфатазы типа I
Стр.
1.3.3.2. Фосфорилирование регуляторной субъединицы сАМРзависимой
протеинкиназы типа П.
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
П.1. Клетки шн ЗТЗ, их культивирование
и обработка
П.2. Углубление клеток в состояние покоя.
П.З. Определение активности 2фосфодиэс
теразы в клеточном гомогенате.
П.4. Определение активности 2фосфодиэстеразы при выделении фермента и определение активности ингибитора 2фос
фодиэстеразы.
П.5. Синтез Рн2,5олигоА.
П.6. Определение активности фосфодиэсте
разы с АМР
П.7. Определение активности сАМРзависимой
протеинкиназы.
П.8. Определение уровня 2 ,5олигоА.
П. 9. Определение уровня сАМР.
П.Ю.Фосфорилирование клеточного гомогената
П.П. Ввделение 2фосфодиэстеразы.
П Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях.
П. . Определение включения 1тимидина
клетками ига зтз.
П Определение концентрации белка
П. . Измерение радиоактивности в пробах.
Стр.
П Реактивы и культуральные среды, использованные в работе.
ГЛАВА ш РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Ш.1. Изменение уровня сАМР при обработке
клеток адреналином и теофиллином
Ш.2. Изменение активности 2фоофодиэстеразы при обработке клеток адреналином и тео
филлином
Ш.З. Изменение активности 2,фосфодиэстеразы при обработке клеточного гомогената
протеинкиназой
Ш.4. Динамика сАМРзависимого фосфорилирования, активности 2фоофодиэстеразы и уровня 2,5олигоА при углублении
клеток в состояние покоя
Ш.5. Изменение активности 2фосфодиэстеразы
при обработке клеток 2,болигоА.
Ш.6, Выделение 2фосфодиэстеразы
Ш.7. Белковый ингибитор 2фоофодиэстеразы.
ГЛАВА 1У. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
вывода
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Молекулы без 5концевых фосфатов с общей формулой А2р5Ап получили. В клетке существуют два фермента, обеспечивающие поддержание концентрации 2,5олигоА на определенном уровне 2,5олигоАсинтетаза, осуществляющая синтез 2,болигоА из АТР, и 2фосфодиэстераза, гидролизующая 2,5олигоА до АТР и АМР . Впервые 2,5олигоАсинтетаза К. Ф.2. Эрлиха и клеток НеЬа 7. Частично очищенная 2,5олигоАсинтетаза была выделена из клеток мыши 9, клеток куриного эмбриона и ретикулоцигов кролика ,,. В клетках асцита Эрлиха были обнаружены две формы фермента с молекулярными массам и 00 далътон 9. Высокомолекулярная форма фермента обнаружена в основном в цитоплазме, низкомолекулярная. Этим формам соответствуют два типа мРНК 3,8 тыс. Характерной особенностью этих форм данного фермента, полученных из разных источников, является их зависимость от двуспиральной. РНК, дсРНК, которая необходима для активации фермента ,. При длине молекул дсРНК меньше, чем пар оснований, фермент не активируется, при длине более пар оснований происходит максимальная активация 9. Двуспиральная ДНК. ДНКРНК неспособны заменить дсРНК при активации 2,5олигоАсинтетазы . Помимо своей основной функции переноса остатков АМР на 2,5олигоА, 2,5олигоАсинтетаза способна присоединять , к 2,5олигоА один нуклеотид, отличный от аденилового, а также присоединять, по. Второму ферменту 2фосфодиэстеразе К. Ф.3. Еще один непременный компонент системы 2,,5,олигоА это рибонуклеаза. РНКаза ъ К. Ф.3. I 2,,5о. Асинтетаза 2. Ап РНКаза ь неактивн. РНКазаЬ активы. Ап гдепз. РНКаза Ь была вццелена из клеток асцита Эрлиха . Изучение механизма ее активации 2,5олигоА позволило предположить, что этот процесс обусловлен непосредственным связыванием олигонуклеотида с ферментом III. Активированная РНКаза ъ гидролизует одноцепочечные участки вирусной РНК, а также клеточные мРНК и рРНК, но с различными скоростями. Никакой специфичности этой РНКазы в отношении вирусной РНК не обнаружено III, однако высказывались предположения о том, что в клетке происходит предпочтительный гидролиз одноцепочечных участков вирусной РНК, расположенных . РНКзависимого синтеза 2. СА вблизи этих участков 7. РНКаза ь, активированная 2,5олигоА, из четырех обычных гомополирибонуклеотидов гидролизует только полни, тогда как в природной вирусной РНК гидролизу подвергаются последовательности ил, ио И ш . Молекулярная масса РНКазы ь, определенная методом гельфильтрации, составляла дальтон активация этого фермента его момолекулярной массы не изменяла 6. Интерес к 2,5олигоА первоначально был связан главным образом с тем, что содержание его в клетках значительно увеличивалось после обработки их интерфероном III. В клетках, не обработанных интерфероном, уровень 2,5олигоА настолько низок, что зарегистрировать его с определенной точностью не представляется возможным. Но при заражении клеток вирусом энцефаломиокардита ВЭМК наблвдался подъем уровня 2,5олигоА,. В связи с этим высказывается предположение, что для обеспечения высокой активности 2,5олигоАсинтетазы необходимо присутствие дополнительной дсРНК, в данном случае вирусной. При заражении клеток i ВЭМК концентрация 2,болигоА, исходно не превышающая I нМ, возрастает приблизительно до 45 нМ, а при заражении ВЭМК клеток, предварительно обработанных интерфероном, уровень 2,5олигоА возрастал до 89 нМ 5. Увеличение содержания 2,5олигоА после воздействия на клетки интерферона определяется, главным образом, увеличением активности 2,5олигоАсиптетазы. Фермент активируется в различной степени это зависит от вида клеток, от типа интерферона, его концентрации, продолжительности обработки и т. Предполагают, что повышение активности 2,5олигоАсинтетазы обусловлено увеличением содержания соответствующей мРНК, происходящим после экспрессии гена или генов . Индукция 2,5олигоАсинтетазы была обнаружена не только в клеточных системах, но и в лизатах.