Исследование контрольных точек клеточного цикла клеток тератокарциномы мыши линии F9 при действии повреждающих агентов

• Автор: Малашичева, Анна Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 164 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования.

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна работы.

1.5. Теоретическое и практическое значение работы.

1.6. Апробация работы

1.7. Объм и структура диссертации.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Регуляция клеточного цикла

2.2. Контрольные точки клеточного цикла
2.2.1. Роль белков р и рЛУаП в функционировании
контрольных точек
2.2.1.1. Контрольные точки повреждения ДНК.
2.2.1.2. Контрольная точка сборки веретена деления.
2.3. Опухолевый супрессор р структу ра и функции
2.3.1. Общие сведения
2.3.2. Участие белкар в эмбриональном развитии.
2.3.3. Структура белка р.
2.3.3.1. Иконцевой домен белка р
2.3.3.2. Центральный домен белка р.
2.3.3.3. Сконцевой домен
2.3.4. Гомологи белка р.
2.3.5. Участие белка р в ответе на стрессовые воздействия
2.3.6. Механизмы активации белка р.
2.3.6.1 .Опосредованная белком гпс1гп2 деградация белка р
2.3.6.2. Активация белка р при помощи белка АКР
2.3.6.3. Независимая от белка Мс1т2 деградация белка р.
2.3.6.4. Регуляция активности белка р путем фосфорилирования
2.3.7. Мишени белка р
2.4. Ген рЛУаП.
2.4.1. Белок рЛУаП участвует в остановке клеточного цикла
2.4.2. Регуляция рАУаП.
2.4.2.1 .Зависимая от белка р регуляция гена рЛгаП
2.4.2.2. Независимая от белка р активация гена рЛгаЛ
2.4.4.3. Посттранскрипционная регуляция экспрессии гена
2.4.3. рКЬзависимый путь опухолевой супрессии.
2.5. Тератокарциномы и эмбриональные стволовые клетки.
2.5.2. Регуляция клеточного цикла ранних эмбриональных клеток млекопитающих.
2.5.3. Белок р в клетках эмбриональных карцином и в эмбриональных стволовых клетках
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
3.1. Культивирование клеток.
3.2. Облучение клеток и обработка ингибиторами клеточного цикла
3.3. Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла
3.4. Анализ активации транкрипции репортерных плазмид.
3.5. Анализ содержания белковрегуляторов клеточного цикла методом иммуноблоттинга
3.6. Анализ конформационного состояния белка р методом иммунопреципитации.
3.7. Анализ связывания белков и р
с циклинкиназными комплексами
3.8. Анализ функциональной активности.
циклинкиназных комплексов i vi.
3.9. Оценка гибели клеток.
3.9.1. Метод клоногенной выживаемости.
3.9.2. Оценка жизнеспособности клеток.
по активности митохондриальных ферментов
3.9.3. Анализ фрагментации клеточной ДНК
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Повреждающие агенты не вызывают в клетках 9 полноценных осшювок клеточного цикла в контрольных точках
4.1.1. Ионизирующее излучение не вызывает остановку клеточного цикла 1 в клетках 9.
4.1.2. Повреждение ДНК клеток 9 адриамицином не приводит к блокированию входа в фазу .
4.1.3. Остановка 1 не происходит в клетках 9 при блокировании синтеза нуклеотидов.
4.1.4. Ингибирование митотического веретена вызывает полиплоидизацию в клетках
4.2. Поврежднные клетки 9 вступают в апоптоз
4.3. Анализ активации рзависимого пути в клетках 9 придействии повреждающих агентов.
4.3.1. Белок р в клетках 9 функционально активен.
4.3.2. Клетки 9 имеют низкое содержание белка .
4.3.3. Белок рЛаП подвергается протеасомной деградации в клетках Б9.
4.4. Анализ содержания циклинов, циклинзависимых киназ и активности циклинкиназньгх комплексов в клетках 9.
4.5. Анализ связывания белка рУаП с циклинкиназными комплексами
4.6. Эмбриональные стволовые клетки не имеют полноценных остановок клеточного цикла в контрольных точках
4.6.1. Анализ клеточного цикла ЕБ клеток в ответ на действие повреждающих агентов.
4.6.2. Анализ функций белка рЛУаП в облучнных ЕБ клетках
4.7. Анализ изменений, происходящих в клетках
при дифференцировке
4.7.1. Индукция дифференцировки клеток Б9 приводит к изменению структуры клеточного цикла
4.7.2. Статус белка р не изменяется при дифференцировке
клеток Б9.
4.7.3. Изменения активности циклинкиназных комплексов при дифференцировке клеток 9
4.7.4. Анатиз свойств белков рЛУаП и р
при дифференцировке клеток 9.
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.
5.1. Анализ функционирования рКЬзависимого пути в клетках Е9
5.1.1. Клетки 9 имеют функционально активный белок р и низкое содержание белка рЛУаП
5.1.2. Белок р не связывается в клетках Б9 с комплексами, содержащими циклин Е
5.1.3. Активность комплексов, содержащих циклин Е,
определяет ответ клетки на повреждение ДНК
5.1.4. Уровень фосфорилирования белка Шэ не изменяется после повреждения ДНК в клетках Б
5.2. Анализ остановки Ы после повреждения ДНК в клетках Р9.
5.3. Анализ функционирования митотической контрольной точки
в клетках
5.4. Контроль целостности генома в клетках Р9.
5.5. Запуск апоптоза в клетках Б9 в ответ на действие повреждающих агентов.
5.5.6. Анализ участия белка р в запуске апоптоза в клетках Р9.
5.5.7. Регуляция клеточного цикла и апоптоз.
5.6. Анализ Б блока в дифференцированных клетках Р9.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Однако если бы для возникновения рака было достаточно лишь одной мутации в одном гене, то по теории вероятностей, учитывая частоту спонтанного мутирования 6, существование высокоорганизованного многоклеточного организма было бы невозможно изза постоянного образования опухолей. Существует множество указаний на то, что для возникновения рака необходимо совпадение ряда весьма редких, независимых событий в одной клетке изменения, ведущие к неоплазии, возникают гораздо реже, чем спонтанные мутации, и с этой точки зрения проблема рака состоит не в том, почему он вообще возникает, а почему он возникает так редко. Очевидно, существует особый механизм отслеживания и обезвреживания изменений, способных привести к опухоли i, . Тем не менее, опухоли возникают, так как даже в работе самого точного механизма неизбежны ошибки. Наиболее часто опухоли возникают вследствие нарушения регуляции клеточного цикла. Клеточный цикл всех клеток состоит из нескольких фаз и контролируется сходным образом рис. I, а. Во время фазы 1 происходит увеличение размера клетки и подготовка к синтезу ДНК далее следует фаза , во время которой реплицируется ДНК затем короткая фаза 2, после чего наступает митотическая фаза М. Клетка постоянно является мишенью митогенных и антимитогенных внешних сигналов, влияние которых воспринимается клеткой главным образом в фазе 1. В конце фазы существует так называемая точка рестрикции, прохождение которой зависит от наличия сигналов от митогенов, или ростовых факторов. После прохождения точки рестрикции клетка коммитирована к завершению цикла деления даже в отсутствие митогенных сигналов , . Переходы по фазам клеточного цикла контролируются специфическими для данного перехода комплексами белков циклинов с циклинзависимыми киназами i i. Митогенные сигналы вызывают сборку циклинкиназных комплексов в определенной последовательности Рис. Циклин яатяется регуляторной единицей такого комплекса, а циклинзависимая киназа каталитической, и эти комплексы активируются последовательно при переходах от фазы к фазе клеточного цикла. Циклины экспрессируются в клетке в зависимости от фазы цикла, а циклинзависимьге киназы, напротив конститутивно, активируясь только б комплексе с цикл ином. Помимо образования комплекса с циклином, сигналом активации или инактивации циклинзависимой киназы может являться е фосфорилирование или дефосфорилирование но определнным остаткам, осуществляемое специфическими вышележащими киназами и фосфатазами , Рис. Существуют также специфические белки, ингибирующие работу циклинкиназных комплексов путем прямого связывания с этими комплексами ингибиторы циклинзависимых киназ. Такие белки относятся к двум генетическим семействам С I iii i и I4 iii . К первому семейству принадлежат белки , I, рК2, являющиеся универсальными ингибиторами циклинкиназных комплексов и способные подавлять активность различных циклинкиназных комплексов ко второму белки р, р, р, р , подавляющие только киназную активность киназ 4 и 6 , . Опухолевый супрессор р и продукт гена ретинобластомы , участвуют в регуляции клеточного цикла и тесно связаны с функционированием циклинкиназных комплексов. Белок необходим для прохождения нормального клеточного цикла. Уровень фосфорилирования этого белка меняетсяща протяжении клеточного. Рис. Общая схема регуляции клеточного цикла в клетках млекопитающих. А. Прохождение разных фаз клеточного цикла контролируется специфическими комплексами цикликзависимых киназ ск и циклинов. Комплексы циклинов типа О с киназами ск и комплекс сс1к2циклин Е осуществляют поэтапное фосфорилирование белка ЛЬ. В гиперфосфорилированном состоянии белок ЯЬ теряет способность подавлять функцию транскрипционного фактора Е2Р, и запускается транскрипция генов, ответственных за прохождение фазы 5 продолжение рисунка на след. Рис. Б. Регуляция активности циклинкиназного комплекса. Циклинзависимая киназа в комплексе с циклином приобретает или теряет киназную активность в результате фосфорилирования или дефосфорилирования по специфическим тирозиновым сайтам по Еебе, .