Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli

• Автор: Кукарин, Александр Вячеславович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 75 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Краткие сведения о ДНК зависимой РНК полимеразе бактериофага Т7 Escherichia coii.
2. Этапы транскрипционного цикла
2.1 Инициация
2.2 Элонгация
2.3 Терминация
3. Терминационные последовательности РНК полимеразы бактериофага Т
3.1 Терминационные последовательности первого класса (образующие стабильные
шпилькообразные структуры)
3.1.1 Влияние контекста последовательности матрицы перед терминаторами первого
класса
3.1.2 Влияние стабильности шпильки
3.1.3 Влияние А:Т богатого участка, расположенного после шпильки
3.2 Терминационные последовательности второго класса
3.2.1 Роль нематричной цепи в процессе терминации
3.2.2 Роль последовательности ДНК в терминации на сигналах второго класса
3.2.3 Влияние контекста последовательности матрицы на терминацию второго
класса
3.2.4 Последовательность консенсуса является сайтом паузы Т7 РНК полимеразы .
3.2.5 Роль А:Т богатой последовательности, расположенной после консенсуса, в
терминации
4. Мутантные ферменты со сниженной эффективностью терминации на ПТГ
5. РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные
последовательности второго класса
6. Модель терминации на шпилькообразующем терминаторе
7. Кинетическая модель терминации
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы
бактериофага Т
1.1 Приближения РНК-полимеразы к однонитевому промотору при помощи ДНК связывающего домена белка ЄаІ4 не достаточно для инициации транскрипции
1.2 Двуцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность участка связывания промотора, активирует транскрипцию на однонитевой матрице
1.3 Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации
1.4 Модель активации транскрипции участком связывания промотора іп Ь-апв
1.5 Удаление интеркалирующей петли не приводит к транскрипции на однонитевой матрице
2. Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона
паращитовидной железы человека
2.1 Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ПТГ терминаторе
2.2 Обе цепи двойной спирали ДНК необходимы для функционирования ПТГ терминатора
2.3 Нарушения двуспиральносги ДНК перед ПТГ терминатором негативно отражаются на его функциональности
ВЫВОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы
Плазмиды
Питательные среды
Приготовление компетентных клеток и трансформация бактерий

Выделение плазмидной ДНК
Использование ферментов в процедурах клонирования
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях
Анализ первичной последовательности ДНК
Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных
гелях
Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях
Транскрипция in vitro
Приготовление транскрипционных матриц из синтетических ДНК олигонуклеотидов.... 63 Получение точечных мутаций при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза

Метод разделения ДНК в неденатурирующих условиях
Метод изменения электрофоретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле..
Выделение Т7 РНК полимеразы с использованием аффинной хроматографии
Выделение Т7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии
Выделение GAL4-T7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

комнатной температуры (дорожки 2, 3). Меченный по 5'- концу олигонуклеотид-шпильку (1С12 (дорожка 4) добавляли к матричной цепи (МЛ) (дорожки 5 и 7). В дорожках 8 и 10 смеси инкубировали 10 мин. при 70°С, затем медленно охлаждали до комнатной температуры. В дорожках 3, 7 и 8 для получения максимального выхода продукта гибридизации добавляли 10-кратный избыток матрицы. Продукты реакции гибридизации разделяли в 10% полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях.
РНКП1пМ1 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 0 10 50 100
МЛ 1пМ1 50 50 50 50 50 0 10 50 100 200 50 50 50 50
РС12 (пМ) 0 10 50 100 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
Дорожка 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Рис. 11. Титрование компонентов реакции. В дорожках 1-5 представлено титрование олигонуклеотида- шпильки при постоянной концентрации однонитевой матрицы и РНКП. Максимум выхода продукта достигается при соотношении матрица: шпилька : РНКП = 2,5 : 5 : 1. В дорожках 6-10 для титрования матрицы использовали заведомо повышенную концентрацию РС12 при этом насыщение достигается в соотношении матрица : РНКП = 1 :