Транскрипционная активность в генетических локусах E. coli, содержащих потенциальные промоторы для синтеза антисмысловых РНК

• Автор: Тутукина, Мария Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 126 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы рефляции экспрессии бактериальных генов на уровне транскрипции.

1.1.1. Регуляторные белки прокариот.

1.1.2. Феномен малых РНК зачем они нужны клетке

1.1.3. Методические подходы, использованные для поиска малых РНК.

1.2. Особенности структурной организации промоторов

1.3. Общие представления о механизмах образования транскрипционного комплекса

1.4. Основные критерии, заложенные в алгоритм поиска стартовых точек транскрипции

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты и методы исследования.
2.1.1. Компьютерные программы и алгоритмы.
2.1.2. Бактериальные штаммы и условия культивирования.
2.1.3. Выделение геномной ДНК .i
2.1.4. Получение радиоактивно меченных олнгодезоксирибонуклеотндов.
2.1.5. Амплификация промоторсодержащих фрагментов участков для последующего анализа i vi и i i.
2.1.6. Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле.
2.1.7 Эксгракция фрагментов ДНК из ПААГ.
2.1.8. Определение нуклеотидной последовательности
фрагментов ДНК по МаксамуДжилберту.
2.1.9. Оценка способности фрагментов ДНК к образованию комплексов с о0РНКполимеразой .i.
2.1 Локализация сайтов полимеразапромоторного взаимодействия
2.1 Определение транскрипционной активности промоторов
i vi
2.1 Клонирование промоторсодержащих фрагментов в вектор
2.1 Выделение суммарной клеточной фракции РНК
2.1 Реакция удлинения праймера i viv.
2.1 Картирование 5концов РНКтранскриггтов 5.
2.1 Количественная ПЦР.
2.1 гибридизация
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выбор генов для экспериментального тестирования.
3.2. Сравнительный анализ данных, полученных i ii,
i vi и i viv
3.3. Структурнофункциональный анализ промоториодобных сайтов, расположенных в гене .
3.4. Структурнофункциональный анализ промоториодобных сайтов в локусе .
3.5. Структурнофункциональный анализ промоториодобных сайтов в локусе x.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Регуляторные белки не входят в состав РНКполимеразы и не являются обязательными компонентами транскрипционного комплекса, но при необходимости способны связываться с ней или с определенными элементами в структуре промоторов. ДНК. Содержание активаторов и реирессоров внутри клетки в большинстве случаев невелико, а их активность обычно контролируется продуктами регулируемых генов по принципу обратной связи. Исключение составляют белки нукпеоида, число которых может достигать 0 молекул на клетку. Учитывая общее содержание того или иного белка в клетке, количество его регулонов и значимость для нормального функционирования генома, можно построить своего рода иерархическую пирамиду, в соответствии с которой наиболее важными регуляторами эффективности процесса транскрипции являются основных белков Рис. Они имеют сложные сетевые взаимоотношения как со своими регулонами, так и между собой. . о о о о . Рис. Многоуровневая иерархическая структура сети регуляторных белков. Ключевыми являются белок регулятор кагаболитных генов ген сгр и один из стфакторов ,. Белок влияет на транскрипцию более ста генов, причем малейшее изменение в конформации ДНК может кардинально изменить его функцию. Так, например, смещение центра его связывания с промотором из активатора в репрессор vi . Сбалансированность всей сети регуляторных взаимосвязей необходима для адекватной экспрессии всего генома, но к настоящему времени стало очевидным, что экспрессия генома зависит, по крайней мере, еще от одного класса регуляторных молекул малых нетранслируемых РНК. Их действие может быть направлено как на конкретные ферменты клеточного метаболизма, так и на продукцию регуляторных белков Сгр, , . Таким образом, для понимания механизмов регуляции генной экспрессии необходимо учитывать совместное функционирование различных типов регуляторных систем. Феномен малых РНК зачем они нужны клетке Долгое время считалось, что большинство молекул РНК за исключением тРНК и рРНК, которые включены непосредственно в процесс трансляции работают в качестве промежуточных носителей генетической информации, передавая ее от гена к аппарату трансляции. Однако, начиная с конца х, это положение было полностью пересмотрено, поскольку оказалось, что в геномах самых разных организмов от бактерий до млекопитающих присутствует множество нетранслируемых молекул РНК. И эти РНК могут принимать участие в регуляции таких важных процессов, как решшкация плазмид, развитие фагов, организация структуры хромосом, транскрипция ДНК, процессинг и модификация РНК, адаптация к стрессовым условиям и общий контроль развития. В настоящее время все подобные молекулы, как прокариотические, так и эукариотические, объединены под общим названием некодирующие РНК i , но применительно к бактериям гораздо чаще используется термин малые РНК . А так как в данной работе речь пойдет именно о бактериальных регуляторных РНК, то в дальнейшем будет использоваться термин малые РНК. Первой исследованной малой РНК . i i . Она имеет длину нт и кодируется собственным геном. Причем ген, экспрессию которого может регулировать эта ген , кодирующий порииовый белок находится совсем в другом генетическом локусе. Эго уже является существенным отличием бактериальных малых РНК от ранее обнаруженных плазмид, бактериофагов и транспозонов, которые синтезируются с противоположной нити регулируемого гена , i , i . На рисунке 3 показан механизм действия i7. Видно, что i образует частично комплементарный дуплекс с участком мРНК перед , закрывая и старт трансляции, и последовательность ШаннДальгарно. Это предотвращает взаимодействие мРНК с рибосомой и полностью ингибирует синтез белка. Аналогичный механизм действия имеют несколько других , в том числе, i нт, ингибирует трансляцию ДмРЫК, влияя на деление клеток, v 4 нт, изменяет экспрессию транспортных оперонов и и i 0 нт, модулирует трансляцию регуляторного белка , i , i, .