Исследование структурных основ субстратной специфичности карбоксипептидазы T Thermoactinomyces vulgaris

• Автор: Гришин, Андрей Михайлович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 224 с.

Введение
Обзор литературы. Рациональное конструирование ферментов с измененной субстратной специфичностью
Введение

Методы рациональной белковой инженерии

Главные направления рационального конструирования ферментов с желаемой субстратной специфичностью
Использование рациональной белковой инженерии для исследования молекулярных основ субстратной специфичности
Поиск и подтверждение роли выбранных остатков, как детерминант субстратной специфичности

Локализация точек мутагенеза

Сдвиг субстратной специфичности фермента в желаемую сторону Вклад работ по рациональному конструированию ферментов в развитие теории ферментативного катализа

Подтверждение классической теории

Доказательство ведущей роли энтальпии связывания в определении субстратной специфичности
Выявление роли энтропийного фактора в определении субстратной специфичности
Развитие теории ферментативного катализа в работах по реконструированию ферментов
Контроль селективности на уровне скорости ферментативной реакции
Роль аллостерической регуляции
Влияние молекулярных движений на субстратную селективность и катализ
Применение ферментов с измененной субстратной специфичностью
Медицина
Промышленность
Сельское хозяйство
Экология и охрана окружающей среды
Научная практика
Теоретические и методические основы коммерческой белковой инженерии .
Проблемы рационального конструирования ферментов с измененной субстратной специфичностью
Перспективы рационального конструирования ферментов
Структурные основы субстратной специфичности ферментов семейства металлокарбоксипептидаз
Карман первичной специфичности МКП
Проблемы теории субстратной специфичности
металлокарбоксипептидаз
Материалы и методы
Материалы
Ферменты и сопутствующие реактивы
Бактериальные штаммы, векторы и плазмиды
Олигонуклеотиды
Приборы, аналитическое оборудование и ассоциированные реактивы
Методы
Стандартные генноинженерные методики
Электрофорез нуклеиновых кислот
Переосаждсние ДНК
Выделение плазмидной ДНК
Трансформация клеток Е.соИ
Рестрикция
Лигирование
Выделение ДНК из агарозного геля
Обработка ДНК щелочной фосфатазой из кишечника теленка Получение мутантных вариантов гена срТ
Получение КПТ и ее вариантов в клетках Е.соЛ
Очистка тел включения
Ренатурация мутантных форм.проКПТ
Активация рснатурированного предшественника КПТ субтилизином Очистка зрелой формы КПТ
Определение концентрации белка
Гельэлектрофорез в денатурирующих условиях
Определение активности КПТ
Определение активности КПТ по синтетическом хромофорному пептидному субстрату ОпрААЯ
Определение активности КПТ по синтетическим пептидным субстратам и
Определение активности субтилизина в препарате КПТ по синтетическому пептидному субстрату 7ААЬр1МА
Определение зависимости активности от
Определение термостабильности КПТ
Определение спектров кругового дихроизма
Программное обеспечение
Формулы для расчетов
Минимизация энергии
Результаты
Получение мутантных вариантов гена срТ
Экспрессия мутантных форм белка в виде телец включения в Е.соН ВЬ ОЕЗрЬу5
Получение зрелой формы КПТ и ее вариантов
Ренатурация тел включения
Активация проКПТ субтилизином
Очистка КПТ и ее вариантов
Ренатурация, активация и очистка КПТ и ее вариантов
Спектры кругового дихроизма КПТ дикого типа и ее вариантов 6 зависимость активности КПТ дикого типа и ее вариантов 7 Молекулярная механика
Определение активности КПТ и ее вариантов
Роль кальция как молекулярной детерминанты субстратной специфичности КПТ
Обсуждение результатов
Стратегия эксперимента
Корректность использованных методов и достоверность полученных результатов
Ген КПТ дикого типа
Экспрессия генов КПТ и ее вариантов
Ренатурация, активация и очистка ферментов
Критерии правильности сворачивания и ее вариантов 9 Определение кинетических параметров
профили некоторых вариантов КПТ
Принятые допущения и возможные причины артефактов
Субстратная специфичность КПТ
Проверка классической теории субстратной специфичности карбоксипептидаз на примере КПТ
Изучение роли отрицательного заряда 3
Изучение влияния положительного заряда в 5 положении на селективность КПТ
Результаты изменения кармана первичной специфичности КПТ в сторону такового глутаматспецифичной карбоксипентидазы 0 Структурные основы селективности КПТ и КПТ
Изучение влияния гидрофобного остатка в 5 положении на селективность КПТ
Сравнение структуры КПА и модели КПТ I
Изучение влияния строения поверхности кармана первичной специфичпности на селективность КПТ
Результаты реконструирования кармана первичной специфичности КПТ по аналогии с КПВ
Сравнение структуры КПВ и модели КПТ5
Причины низкой активности КПТ на положительно заряженных субстратах
Связывание гидрофобных субстратов КПТ
Связывание отрицательно заряженных субстратов КПТ
Недостаточность современных представлений о структурных основах субстратной специфичности КПТ
Поиск новых детерминант субстратной специфичности КПТ
РольН1б
Роль ионов Са
Роль длины петли активного центра с Туг8
РольЬеи7
Итоги, проблемы и перспективы исследования
Выводы
Список публикаций по теме диссертации
Список использованной литературы


Работы но этой тематике являются, пожалуй, главным критерием нашего понимания связи структуры и функции белка и , . Несмотря на амбициозность задачи получения белка v, на данный момент уже имеются примеры успешного дизайна белков. Вехами развития направления стали дизайн белка, структурно аналогичного ДНКсвязывающему домену цинковый палец i и Мауо, , создание правозакрученной двойной суперспирали и др. В нашей стране это направление развито благодаря совместным работам исследовательских коллективов под руководством Л. Финкельштейна и М. Кирпичникова, которые первые в мире создали белок с новой структурой и заданной функией альбебетин v и др. Примеров полностью искусственных ферментов пока нет. Безусловно, на текущий момент направление находится в стадии становления. В то же время имеются работы по созданию ферментов с желаемой специфичностью на основе каталитически инертных белков. Одно из ведущих мест в этой области занимает группа X. Хеллинги. Начиная с г. Исследователям этого коллектива удалось, взяв за основу рибозосвязывающий белок, не обладающий каталитической активностью, сконструировать аналог триозофосфатизомеразы и др. С помощью специально разработанного компьютерного алгоритма i и i, , была сконструирована лигандсвязывающая поверхность для фосфоглицероальдегида и дигидроксиацетонфосфата, а также три каталитических остатка , i и , наиболее важные в каталитическом центре триозофосфатизомеразы, были помещены в оптимальное положение. Суммарно было введено мутаций, изменяющих свойства аминокислот, контактирующих с субстратом и 5 остатков, расположенных во втором слое. Правильность расчетов была подтверждена экспериментально, поскольку полученные ферменты ускоряли желаемую реакцию до 6 раз, хотя их каталитическая эффективность была все еще на 2 3 порядка ниже, чем у триозофосфатизомеразы и др. Подобно работам Х. Хеллинги, Д. Болон и Л. Майо, с помощью алгоритма I, каталитически инертному тиоредоксину придали способность гидролизовать янитрофенилацетат и Мауо, . В случае если исходный белок обладает субстратсвязывающей поверхностью, достаточно лишь имплантировать ему каталитически важные остатки. Так, циклофилин цистранс изомераза Х пептидных связей была переделана в эндопептидазу благодаря постановке каталитической триады сериновых протеаз в оптимальное положение зоны связывания и др. В зависимости от структурнофункциональной организации фермента, могут использоваться и другие стратегии дизайна v, например, не затрагивающие каталитический центр и субстратсвязывающую поверхность. А и В, каждый из которых узнает половину сайта мишени длиной нуклеотидов, обладающего псевдозеркальной симметрией. Исследователям группы Д. Бейкера удалось получить iэндонуклеазу с новой специфичностью через объединение доменов ферментов I и I vi и др. Соответственно сайт узнавания новой эндонуклеазы был комбинацией из половин сайтов I и I. Первоначальная модель гибридного белка показала отсутствие комплементарности поверхностей двух доменов, поэтому для создания белокбелкового контакта был использован расчетный алгоритм . Из 8 возможных вариантов, в конечном счете, были отобраны . Они были получены экспериментально. Три варианта, которые экспрессировались лучше других, были охарактеризованы i vi. Показано, что их специфичность действительно изменилась в желаемую сторону. Кинетические параметры одного из вариантов были определены количественно вариант обладал 0 нМ аффинностью к ДНК и скоростью расщепления, сравнимой с таковой исходных ферментов. Структура варианта, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа доказала правильность компьютерного алгоритма vi и др. Наибольшее число работ по получению ферментов с желаемой селективностью действия относится к реконструированию уже существующих ферментов. Модификации подвергают как субстратсвязывающий участок, так и каталитический центр. Так, ориентируясь на данные молекулярного моделирования Танаке и Йоде удалось превратить аспартатную протеазу пепсин в сериновую протеазу и , . Похожая работа была проведена Байрдом и соавт.