Процессы сворачивания-разворачивания и стабильность белков, имеющих структуру типа бета-бочонка

• Автор: Степаненко, Олеся Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 136 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цели и задачи исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и фолдинг белков современные представления.

1.2. Флуоресцентные белки.

1.2.1. Спектральные свойства флуоресцентных белков
1.2.1.1. Флуоресцентные белки из класса Апбюгоа.
1.2.1.2. Флуоресцентные белки из других классов организмов
1.2.1.3. Аециогеа СГР и его улучшенные варианты
1.2.1.4. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
1.2.2. Структурные свойства флуоресцентных белков.
1.2.2.1. Пространственная структура, топология и олигомеризация.
1.2.2.2. Механизмы образования хромофора
1.2.2.3. Микроокружение хромофора.
1.2.3. Конформационная стабильность флуоресцентных белков.
1.3. Одорантсвязывающие белки
1.3.1. Лиганды ОВРб.
1.3.2. Трехмерная структура ОВРб
1.3.3. Комплексы ОВР с молекулами одорантов
1.3.4. Предположительная роль ОВРб
1.3.5. Конформационная стабильность рОВР
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы.
2.2.1. Анализ пространственной структуры белка
2.2.2. Флуоресцентные измерения.
2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
2.2.4. Измерение спектров круговой дихроизма.
2.2.5. Измерение равновесных кривых денатурации.
2.2.6. Измерение кинетических кривых денатурации белков.
2.1.7. Тушение флуоресценции акриламидом
2.2.8. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачиванияразворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы.
2.2.9. Расчет кинетических параметров.
2.2 Расчет термодинамических параметров.
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Особенности процессов денатурации БОБР и его мутантных форм с
ЗАМЕНАМИ В ПОЛОЖЕНИИ .
3.1.1. Экспрессия НСБ и его мутантных форм в бактериальных клетках.
3.1.2. Кинетика созревания хромофора ЕСРР и его мутантных форм
3.1.3. Влияние точечных аминокислотных замен в положении на структуру ЕСРР
3.1.4. Особенности денатурации ЕвРР иод действием Сс1пНС1. Влияние замен в положении на стабильность ЕвРР
3.2. РОЛЬ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ В СТАБИЛИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ .
3.2.1. Спектральные свойства мономерных и олигомерных РРб.
3.2.2. Вторичная и третичная структура флуоресцентных белков
3.2.3. Спектры флуоресценции и доступность хромофора молекулам растворителя
3.2.4. Особенности триптофановой флуоресценции
3.2.5. Кинетика денатурации иод действием гуанидингидрохлорида
3.2.6. Квазистационарные зависимости
3.3. Разворачиваниесворачивание ОВР под действием СпкТГСе и нагревания.
3.3.1. Локальные предденатурационные изменения структуры ОВР иод действием небольших концентраций СбпНО
3.3.2. Устойчивость структуры ОВР к денатурирующему действию Ос1пС1
3.3.3. Тепловая денатурация ОВР
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Большой вклад в развитие представлений о том, как же белки сворачиваются в уникальную нативную структуру, был сделан Аифинсеном, показавшим, что аминокислотная последовательность белка содержит всю информацию, необходимую для его фолдинга в нативную структуру i, . Следует заметить, что при фолдингс в определении контактов, возникающих в третичной пространственной структуре белка, могут участвовать удаленные по цепи аминокислотные остатки, при этом определяющую роль играют лишь некоторые аминокислотные остатки. По этой причине гомологичные белки иногда с достаточно низкой гомологией имеют одинаковую структуру. С другой стороны, одна единственная аминокислотная замена может существеннейшим образом сказаться на скорости сворачивания, или даже полностью нарушить правильное сворачивание белка Р1о1кчп, ОписЫс, Финкслыптсйн, Птицын, . Сворачивание белка заключается в поиске уникальной функциональноактивной нативной структуры среди большого числа конформаций, которые может принимать полипептидная цепь. Однако расчет показывает, что перебор всех возможных конформаций в поисках нативного состояния, отвечающего минимуму свободной энергии, даже для небольшого белка из ста аминокислотных остатков потребовал бы биллион лет ЬеушФа При этом сворачивание белка осуществляется за значительно более короткий промежуток времени обычно от миллисекунд до секунд. Этот факт, известный как Парадокс Левинталя, делает очевидным, что в аминокислотной последовательности запрограммирована не только структура нативного состояния макромолекулы белка, но и пучь его достижения. Другой важной особенностью полипептидной цепи любого белка является то, что она обеспечивает существование свободноэнергетического барьера между нативным и денатурированным развернутым или промежуточным состояниями Фимкелыитейн, Птицыи, . Это обстоятельство чрезвычайно важно для правильного функционирования белков. Современные представления о фолдинге белка реализованы в модели энергетической воронки, объединяющей как ранее существовавшую модель кооперативного сворачивания небольших однодоменных белков, так и модель сворачивания белков с образованием промежуточных состояний. Согласно модели энергетической воронки переход от полностью развернутого в уникальное нативное состояние белка определяется энергетической поверхностью, т. i . . , , . Полностью развернутому состоянию полипептидной цепи на этой энергетической поверхности отвечает широкое плато свободной энергии, отражающее реализацию этого состояния огромным числом конформаций основной цени. Переход от полностью развернутого в нативное состояние может осуществляться различными путями. Число возможных конформационных состояний полипептидной цепи уменьшается по мере приближения к нативному состоянию, поэтому такую энергетическую поверхность часто называют также энергетической воронкой. Наряду с глобальным минимумом свободной энергии, отвечающему нативному состоянию, возможно существование локальных минимумов свободной энергии, отвечающих существованию частичносвернутых промежуточных состояний белка. Модель энергетической воронки также позволяет представить возникновение агрегированных структур, а именно, аморфных агрегатов и упорядоченных амилоидных фибрилл. Достижение минимума свободной энергии за счет возникновения внутримолекулярных контактов приводит к образованию нативной структуры. Достижение минимума свободной энергии за счет возникновения межмолекулярных контактов приводит к возникновению ассоциатов, аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл. Модель энергетической воронки позволяет предположит Возникновение таких промежуточных состояний может инициировать ассоциацию или агрегацию макромолекул. В связи с тем, что возникновение амилоидных фибрилл сопряжено с развитием ряда тяжелых заболеваний таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и т. Для все большего числа белков удается подобрать условия, при которых такие структуры возникают i vi . Установлено, что амилоидные фибриллы разного происхождения имеют сходную морфологию.