Создание бактериального продуцента антигенной детерминанты панкреатической холистеролэстеразы человека и разработка на его основе иммуноферментного анализа для определения аутоантител

• Автор: Ильина, Елена Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 86 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список принятых сокращений
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Особенности структурной организации молекулы пХЭ; ее биологические и иммунологические свойства
1.2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности
кДНК пХЭ; организация гена пХЭ
1.3. Роль пХЭ в нормальных физиологических условиях и в патологии
Глава И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Клонирование, определение первичной структуры и экспрессия в
E. coli иммуногенного белка - С-терминального участка пХЭ человека
3.2. Локализация линейной антигенной детерминанты пХЭ в пролин-богатых повторах
3.3. Разработка ИФА для определения антител к пХЭ в сыворотке человека и животных
3.4. Выявление антител к пХЭ человека у больных с кистами головки
поджелудочной железы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Список работ, опубликованных по теме диссертации
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
BSA - бычий сывороточный альбумин
PBS - фосфорно-буферная смесь
SDS - додецил сульфат Na
TBS - трис-буферная смесь
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - ДНКовая копия мРНК
мРНК - матричная РНК
ПААГ - полиакриламидный гель
пХЭ - панкреатическая холестеролэстераза
РНК - рибонуклеиновая кислота
ЭДТА - этилендиамин тетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ
Начиная с середины текущего столетия в связи с внедрением достижений биологической науки в практику здравоохранения произошли существенные изменения в структуре заболеваний человека. Изменился спектр инфекционных заболеваний за счет широкого применения антибиотиков и вакцинации населения против наиболее опасных микроорганизмов, возросла доля внутренних болезней, обусловленных нарушением нормальных физиологических процессов, протекающих в человеческом организме. Согласно данным, опубликованным в ежегодном докладе Всемирной Организации Здравоохранения, число онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и ряда других хронических болезней, ежегодно уносящих жизни 24 миллионов людей на планете, возрастет и достигнет в следующем тысячелетии сотен миллионов. Среди них отдельно следует выделить патологические процессы, связанные с нарушением обмена веществ (эндокринные заболевания) и онкологические заболевания. Так, ожидается, что в течение ближайших 25 лет количество заболеваний раком в большинстве стран мира удвоится. Диагностика внутренних болезней, особенно превентивная диагностика, весьма затруднительна, так как клиническая картина болезни наблюдается при уже значительных поражениях органов и тканей.
Одной из основных задач клинической биохимии является поиск новых гуморальных маркеров для дифференциальной диагностики различных заболеваний внутренних органов и прогнозирования их осложнений и тяжести течения. Такого рода маркерами могут служить

1:15000. После отмывки TBST связавшийся конъюгат выявляли в реакции с 0.01% Н2О2 в присутствии 0.04% DAB (3,3’-диаминобензидина тетрагидрохлорида) в TBS.
Выделение плазмилной ЛНК.
Использовали метод щелочного лизиса [4] с некоторыми модификациями. Выбранную колонию переносили в 3 мл LB (в 100 мл для препаративного выделения) и растили ночь при рекомендованной для данной культуры температуре. Осадок от 3 (100) мл биомассы
суспендировали в 100 мкл (3 мл) раствора 1 (25 мМ Трис, 50 мМ глюкоза, 20 мМ ЭДТА, 0,2% лизоцим) и инкубировали при комнатной температуре до появления сильной вязкости. К полученной однородной массе добавляли двойной объем раствора 2 (0,2 М NaOH, 1% SDS), перемешивали и выдерживали во льду 10 минут. В прозрачную суспензию вносили 150 мкл (5мл) ЗМ CHsCOONa (pH 4,8), перемешивали до формирования творожистого осадка и инкубировали 20 минут во льду. Лизат осветляли центрифугированием 10 минут при 14000 об/мин. ДНК осаждали из супернатанта добавлением 0,7 объема изопропанола. Смесь инкубировали 15 минут при комнатной температуре и центрифугировали 10 минут при 14000 об/мин. Осадки ДНК, полученные после центрифугирования смеси с изопропанолом, растворяли в 100 мкл (1 мл) ТЕ, добавляли 1 (10) мкл РНКазы и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Последующую очистку от белковых примесей проводили смесью фенол : хлороформ (1 : 1), внесенной в раствор ДНК в равном объеме. Суспензию перемешивали и центрифугировали для разделения фаз. Верхнюю фазу отбирали и осаждали плазмидную ДНК путем добавления 1/10 объема ЗМ