Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов

• Автор: Поздняков, Сергей Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

Введение.

1. Обзор литерату ры

1.1. Противовирусные вакцины.

1.1.1. Цельновирионные вакцины.

1.1.1.1. Живые аттенуированные вакцины

1.1.1.2. Инактивированные вакцины.

1.1.2. Вакцины на основе вирусных антигенов

1.1.2.1. Живые генноинженерные поливалентные вакцины.

1.1.2.2. ДНКвакцины

1.2. Мукозальные вакцины.
1.2.1. Иммунитет слизистых оболочек
1.2.2. Съедобные вакцины на основе трансгенных растений
1.2.2.1. Перенос генов из бактерий рода i в растения
1.2.2.2. Экспрессия чужеродных генов в растениях
1.2.2.3. Противовирусные вакцины на основе трансгенных растений.
2. Материалы и методы.
2.1. Материалы.
2.1.1. Реактивы, наборы реактивов, ферменты
2.1.1.1. Наборы реактивов.
2.1.1.2. Реактивы.
2.1.1.3. Ферменты и маркеры молекулярных весов
2.1.2. Оборудование и материалы
2.1.3. Бактериальные штаммы, плазмиды
2.1.4. Буферы, растворы, среды.
2.1.4.1. Буферы.
2.1.4.2. Растворы для трансформации клеток . i
2.1.4.3. Растворы для выделения плазмидной ДНК.
2.1.4.4. Питательные среды.
2.1.5. Список праймеров.
2.1.6. Наборы для проведения ИФА
2.1.7. Растения.
2.2. Методы
2.2.1. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции.
2.2.2. Лигирование
2.2.3. Приготовление компетентных клеток . i
2.2.4. Трансформация клеток . i.
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах.
2.2.6. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК
2.2.7. Полимеразная цепная реакция
2.2.8. Введение в ЗОН конец фрагмента ДНК и
2.2.9. Гибридизация.
2.2 Определение нуклеотидных последовательностей ДНК
2.2 Очистка реакционной смеси для секвенирования
2.2 Анализ продукции в тканях трансгенных растений
2.2 Иммунизация мышей.
2.2 Анализ продукции антител у иммунизированных мышей.
2.2 Статистическая обработка данных ИФА.
3. Результа ты и обсуждение.
3.1. Конструирование плазмиды растительной трансформации.
3.2. Получение плазмиды II.
3.3. Перенос плазмиды I в клетки агробактернн.
3.4. Создание трансгенных растений.
3.5. Анализ интеграции целевого гена в геном растений
3.6. Анализ продукции белка I в трансгенных растениях.
3.7. Конструирование плазмиды для ДНКвакцинации.
3.8. Анализ иммуногенности плодов трансгенных томатов
4. Заключение.
5. Выводы.
6. Благодарности
7. Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ антиген
АТ антитело
ВГВ вирус гепатита В
ЕК естественные киллеры
ИС индекс стимуляции
ИФА иммуноферментный анализ
ЛГС липополисахарид
МЕ международные единицы
ОП оптическая плотность
опкрит критическая оптическая плотность
ПАМС патоген ассоциированные молекулярные структуры
РБТЛ реакция бласттрансформации лимфоцитов
СРБ суммарный растворимый белок
СВ свежий вес
ТДНК переносимая ДНК
СТВ Всубъединица холерного токсина
СТЬ цитотоксические Тлимфоциты
ОАР диаминопимелиновая кислота
ББ иммуностимулирующие последовательности
поверхностный антиген вируса гепатита В
ЬТВ термолабильный токсин Е. СоИ
мне главный комплекс гистосовместимости
РК образ распознающий рецептор
ТВ искусственный полиэпитопный белок содержит Т и Вклеточные эпитопы ВИЧ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Дженнер провел успешную вакцинацию против натуральной оспы и через месяц подтвердил защитный эффект. О возбудителе оспы и иммунитете в то время не было ничего известно. Лишь с появлением клональноселекционной теории Бернета г. ТВдифференциации лимфоцитов г. Т и или Вклеток, оставив после себя популяцию клеток иммунологической памяти. При следующей встрече с тем же антигеном именно они способны дать вторичный ответ, который обычно быстрее и эффективнее первичного Медуницын, . В общем виде современная теория противовирусного иммунитета выглядит следующим образом. В отличие от антигенов бактерий все вирусные антигены имеют белковую природу и являются Тзависимыми. Протективными свойствами обладают, как правило, поверхностные белки, обеспечивающие слияние вируса с клеткой, и реже белки, расположенные в глубине частицы вируса. В развитии противовирусного иммунитета участвуют гуморальные и клеточные факторы. Иммунитет направлен на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. Первостепенное значение имеют вируснейтрализующие антитела, реагирующие с поверхностными антигенами вируса. Вируснейтрализующие антитела, блокируют взаимодействие вируса с клеточными рецепторами и тем самым предотвращают его проникновение в клетку. Опсонизация вирионов с помощью антител способствует фагоцитозу и элиминации возбудителя. Вторая форма участия антител иммунный лизис инфицированных клеток. Основное количество противовирусных антител составляют 1С, кроме того, в гуморальном ответе участвуют антитела местного иммунитета, преимущественно 1А, в меньшей степени 1. Тлимфоциты, Тхелперы, ЕКклетки, Тэффекторы замедленной гиперчувствительности, макрофаги. Ответ на любой чужеродный элемент экзогенной и эндогенной природы развивается в результате взаимодействия двух взаимосвязанных компонентов иммунитета системы врожденного и системы приобретенного адаптивного иммунитета. Такое взаимодействие обнаружено у 2 многоклеточных, включая человека Воробьев и др. Общепризнано, что без активации врожденного иммунитета формирование приобретенного вакцинного иммунитета не произойдет. Система врожденного иммунитета распознает чужеродные элементы и передает сигнал распознавания лимфоцитам, что ведет к их активации и развитию протективного вакцинного иммунитета. Клетки врожденной системы иммунитета дендритные, тучные распознают у вирусов особые консервативные и необходимые для выживания патоген ассоциированные молекулярные структуры ПАМС. . рассматриваются как носители эволюционной памяти многоклеточных организмов о том, что такое свое и как оно отличается от чужого. Описано несколько групп растворимые, экспрессированные на клеточных мембранах и локализованные внутриклеточно. Растворимые играют роль опсонинов. Они связываются с поверхностью микроорганизмов, что способствует их фагоцитозу. К растворимым рецепторам относят компонент комплемента, Среактивный белок, iсвязывающий белок, маннозосвязывающий лектин. Другой тин рецепторов нодобные рецепторы i , характеризуемых как ключевой элемент распознавания чужого системой клеток врожденного иммунитета хозяина. Эти рецепторы встроенные во внешнюю мембрану дендритных и тучных клеток. Описано таких рецепторов Воробьев и др. Семенов и Зверев, . События начальных этапов иммунного ответа характеризуют 3х сигнальной моделью. Первый сигнал от дендритной клетки Тлимфоцитам это предъявление в контексте молекул МНСпереработанного антигена МНСглавный комплекс гистосовместимости. Однако такого предъявления недостаточно для запуска вакцинного иммунитета. Необходим второй костимулирующий сигнал. Он генерируется дендритной клеткой после того, как клетка распознает ПАМС. За распознаванием следует созревание дендритной клетки, ее активация и экспрессия на мембране костимулирующих молекул , . Предъявление Тлимфоцитам антигена без костимулирующего сигнала ведет к специфической гипореактивности или анергии.